СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ ГЕЛЕОБРАЗУЮЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ДО АМОРФНОГО СОСТОЯНИЯ И ПЛАВЛЕНИЯ АМОРФНЫХ ОБРАЗЦОВ ЭТИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1998 года по МПК A01N1/00 

Изобретение относится к технологии замораживания и может быть использовано для получения аморфного состояния биологических материалов, в том числе живых клеток.

Известно, что при охлаждении клеточных структур ниже 0^oC вода кристаллизуется. Появление льда в клетке вызывает ионный шок и разрушает клетки [1] . Поэтому для сохранения живых клеток необходимо образцы биологических материалов быстро перевести в аморфное состояние, чтобы избежать ионного шока и разрушения клеток.

Известно, что при нагревании аморфные вещества кристаллизуются вблизи некоторой температуры T_к [2]. При этой температуре идут одновременно процессы плавления аморфной структуры и образования кристаллической решетки.

Известен способ аморфизации веществ, имеющих фазовые P-T диаграммы, подобные водной [3]. Образец в жидкой фазе охлаждается под давлением выше атмосферного до температуры фазового превращения "жидкость-твердое тело", а затем давление уменьшается до атмосферного за время, меньшее, чем время перемещения молекулы вещества на межузельное расстояние в твердой кристаллической фазе. Недостатком этого способа является применение гидростатического давления свыше 1000 атм, что не позволяет аморфизировать живые организмы для хранения их при ультранизких температурах. Этот нижний предел рабочих давлений определяется тем, что температура кристаллизации T_к аморфных образцов водных растворов гелеобразующих веществ, входящих в состав клетки [4], находится вблизи -10^oC.

На фиг. 1 представлены результаты калориметрических измерений при плавлении аморфных образцов состава: кровь + 4% желатина + 8% глюкозы. Аморфные образцы получены вышеприведенным способом [3]. Общий тепловой эффект превращения 1 равен алгебраической сумме: теплоты плавления аморфной структуры 2, скрытой теплоты кристаллизации аморфной структуры 3 и теплоты плавления кристаллической решетки 4. Видно, что процессы плавления аморфной структуры и кристаллизации начинаются в окрестности -10^oC.

Для аморфизации указанных выше водных растворов необходимо путем сброса давления до атмосферного получить аморфное состояние с температурой ниже T_к. Таким образом, температура образца в жидкой фазе должна быть не выше -10^oC, что соответствует давлению, равному 1000 атм, на линии фазового превращения "вода - лед".

Этот способ получения веществ в аморфном состоянии [3] является прототипом изобретения.

Изобретение устраняет вышеотмеченные недостатки известного и от его использования может быть следующий технический результат: уменьшение рабочего давления при аморфизации образцов и плавление аморфных образцов без кристаллизации.

Указанный технический результат достигается за счет того, что на образец, находящийся под гидростатическим давлением, воздействуют вращающимся импульсным электрическим полем, которое препятствует образованию гексагональной структуры льда и понижает температуру кристаллизации, что позволяет уменьшить рабочее давление, при этом вращающееся импульсное электрическое поле предотвращает накопление на поверхности образца свободных электрических зарядов, экранирующих внешнее электрическое поле, и повышает электрическую прочность образца; полученные аморфные образцы биологических материалов нагревают и плавят под указанным давлением для предотвращения их кристаллизации.

При охлаждении воды ниже 0^oC и давлениях менее 2200 атм образуется лед I_h с гексагональной кристаллической структурой [5]. Каждая молекула воды в этой структуре окружена четырьмя молекулами, которые образуют правильный тетраэдр. Молекула H₂O может занимать 6 равновероятных положений в центре этого тетраэдра. Под действием локального электрического поля E_с, созданного ближайшими соседними молекулами, формируются водородные связи, которые имеют определенные длины и образуют между собой углы, равные 109^o52' [6]. Протон, участвующий в водородной связи, может находиться в одном из двух положений, соответствующих минимумам его потенциальной энергии. Средняя энергия колебательного движения молекулы H₂O равна 3kT, где k - постоянная Больцмана и T = 273 K - температура льда. В кристаллической структуре льда молекула воды участвует в трех водородных связях. Значит, на одну водородную связь приходится в среднем энергия kT и глубина потенциальной ямы, в которой находится протон, тоже порядка kT.

Молекула воды обладает большим электрическим дипольным моментом p = 0,63•10^-31 Кл см [7]. Если создать дополнительное локальное электрическое поле напряженностью E_p, то средняя потенциальная энергия диполя H₂O в этом поле будет равна p•E_p. Таким образом, электрическое поле E_p будет конкурировать с электрическим полем ближайших соседних молекул E_c, формирующим водородную связь. Глубина потенциальной ямы, в которой находится протон, уменьшится в среднем на p•E_p/3.

В жидком состоянии среднее координационное число молекулы H₂O равно 4,4 и при температурах около 0^oC образуется льдоподобная структура водородных связей [6]. Для того чтобы понизить температуру кристаллизации воды на ΔT = 10^oC, необходимо создать дополнительное локальное электрическое поле напряженностью

Такую напряженность электрического поля на молекуле H₂O можно создать в водном растворе веществ, прикладывая внешнее электрическое поле с некоторой напряженностью E_o. Следует отметить, что локальное поле E_p может значительно превышать по величине внешнее электрическое поле E_o.

В жидкой фазе водного раствора локальное электрическое поле , действующее на молекулу H₂O, можно представить в виде суммы напряженностей электрических полей:
,
где
- внешнее электрическое поле;
- поле нейтральных молекул;
- поле ионов;
- поле свободных электронов;
- поле ближайших соседних молекул, формирующее водородные связи молекулы H₂O.

Дополнительное локальное электрическое поле является суммой полей:

Поэтому

В постоянном внешнем электрическом поле свободные электрические заряды перемещаются к поверхности образца и через некоторое время:

т.е. свободные поверхностные заряды экранируют внешнее электрическое поле и температура кристаллизации воды не изменятся.

Электрические подвижности свободных электронов и протонов в водных растворах, рассчитанные из эквивалентных электропроводимостей, приблизительно равны:
u± ≈1,5• 10 см/В•с. (6)
Ионы K⁺, Na⁺ и др., находящиеся во внутриклеточной жидкости [4], имеют подвижности в несколько раз меньшие при умеренном внешнем электрическом поле. В сильном электрическом поле подвижности ионов резко возрастают.

Если создать вращающееся внешнее электрическое поле с таким периодом T₀, чтобы свободные электроны и ионы, перемещаясь по поверхности образца, не успевали сделать полный оборот за этот промежуток времени, то электроны и ионы уже не будут экранировать внешнее электрическое поле:

где
d - диаметр образца;
E_o - напряженность внешнего электрического поля;
u± - подвижности электронов и протонов;
n - коэффициент увеличения подвижности заряженных частей в сильном электрическом поле.

В этом случае частота вращения электрического поля должна иметь величину

При d = 10 см, E_o = 5•10⁵ В/см и n≈10:
ν_o > 240 Гц. (9)
С другой стороны, необходимое для поворота молекулы воды время (время релаксации) составляет τ = 2•10^-5 с при 0^oC [6]. Поэтому для того чтобы дипольные моменты молекул H₂O следовали за внешнем полем , его частота должна быть
ν_o < 5•10⁴ Гц. (10)
Вращающееся электрическое поле препятствует накоплению свободных электрических зарядов на поверхности образца. Поэтому уменьшается вероятность инициации разряда в водном растворе жестко зафиксированных неоднородностей на внутренней поверхности контейнера, в котором находится образец.

Электрическая прочность водных растворов веществ, т.е. максимальная величина напряженности электрического поля E_пр, при которой происходит пробой, увеличивается с повышением гидростатического давления и понижением температуры образца.

Электрическая прочность водных растворов увеличивается в импульсных электрических полях, при этом, чем короче импульс электрического поля, тем выше напряженность пробоя жидкости E_пр. Например, при реальной электропроводимости внутриклеточной жидкости σ = 10^-2 Ом•см электрическая прочность в постоянном поле равна 1,9•10⁵ В/см, а в импульсном электрическом поле с длительностью импульса 70 нс электрическая прочность увеличивается до 8,7•10⁵ В/см.

В импульсных полях с длительностью импульсов t_u≈10 c электрическая прочность внутриклеточной жидкости будет порядка 4•10⁵ В/см.

Следует отметить, что приведенные выше данные получены в исследованиях электрического пробоя с помощью металлических электродов, имевших контакт с электропроводящей жидкостью. Если изолировать электроды от электропроводящей жидкости, то электрическая прочность ее должна возрасти, поскольку в этом случае исключается эмиссия электронов с электродов в жидкость.

Таким образом, применяя вращающееся импульсное электрическое поле, изолированные электроды и гидростатическое давление до 100 атм, можно увеличить напряженность внешнего электрического поля E_o до 6•10⁵ В/см без пробоя жидкости. Учитывая, что дополнительное локальное электрическое поле E_p может значительно превосходить по величине поле E, следует ожидать смещения температуры фазового перехода "вода - лед" более чем на 10^oC.

На фиг. 2 показана схема установки для аморфизации водных растворов гелеобразующих веществ; на фиг.3 - графики зависимостей потенциалов электродов ϕ₁ и ϕ₂ от времени t.

Установка содержит камеру высокого давления 1, две пары взаимно перпендикулярных электродов 2 с потенциалами соответственно ϕ₁ и ϕ₂ , передающую давление диэлектрическую среду 3, диэлектрический контейнер 4 с водным раствором вещества 5. Вектор напряженности внешнего электрического поля вращается с угловой частотой ω_o = 2πν_o, соответственно вектор напряженности дополнительного локального электрического поля вращается с той же частотой.

Изменения потенциалов со временем представлены в виде прямоугольных импульсов длительностью t_u≈10^-6 с и промежутками между ними
Δt ≪ τ, (11) ,
где τ = 2•10^-5 с - время релаксации дипольных электрических моментов молекул H₂O при 0^oC, т.е. за время Δt дипольные моменты молекул не успевают вернуться к исходному равновесному состоянию и будут вращаться вместе с внешним электрическим полем . Последовательность импульсов имеет период повторения

где ν_o - частота вращения электрического поля . Число N импульсов потенциалов в каждой пачке является четным для того, чтобы разность фаз между потенциалами ϕ₁ и ϕ₂ взаимно перпендикулярных электродов была точно равна π/4 , при этом внешнее электрическое поле будет вращаться с циклической частотой ω_o = 2πν_o .

Процесс аморфизации водных растворов гелеобразующих веществ заключается в следующем:
а) образец 5 (фиг.2) в диэлектрическом контейнере 4 помещают в камеру высокого давления 1 с жидкой диэлектрической средой 3, передающей гидростатическое давление на образец;
б) в камере высокого давления 1 давление повышают до 100 атм и образец охлаждают до 0^oC;
в) создают вращающееся импульсное электрическое поле с максимальной напряженностью E_o <E_пр и образец охлаждают до температуры фазового превращения "вода - лед", которая определяется внешними параметрами: напряженностью внешнего импульсного электрического поля E_oи величиной рабочего давления;
г) после установления равновесного состояния образца давление уменьшают до атмосферного за время меньшее, чем время перемещения молекулы воды на межузельное расстояние в твердой кристаллической фазе [3];
д) аморфный образец охлаждают для хранения его при ультранизких температурах.

Процесс плавления аморфных образцов без кристаллизации проводится следующим образом:
а) аморфный образец в диэлектрическом контейнере помещают в камеру высокого давления с диэлектрической жидкой средой при температуре ниже температуры его кристаллизации T_к;
б) давление в камере высокого давления поднимают до 100 атм и создают вращающееся импульсное электрическое поле;
в) аморфный образец нагревают до температуры T_к, при которой начинается плавление аморфной структуры, при этом вращающееся импульсное электрическое поле препятствует формированию кристаллической структуры льда;
г) при дальнейшем нагревании аморфного образца до положительных температур происходит его плавление без кристаллизации.

Источники информации
1. Пушкарь Д. Н. , Белоус А.Н. Введение в криобиологию.- Киев: Наукова думка, 1975.

2. Скрипов В.П., Коверда В.П. Спонтанная кристаллизация переохлаждения жидкостей.- М.: Наука, 1984, с.158.

3. Куденко Ю. А. , Серебренников В.Л. Заявка на изобретение N 5009542, CCCР, 1991.

4. Большая медицинская энциклопедия/ Под ред. Петровского Б.В.- М., 3-е изд., 1979, т.10, с.430; т.4, с.315.

5. Калашников Я.А. Физическая химия веществ при высоких давлениях.- М.: Высшая школа, 1987, с.54.

6. Маэно Н. Наука о льде.- М.: Мир, 1988, с. 94,46,115.

7. Киттель Ч. Введение в физику твердого тела.- М.: Наука, 1978.

Способ может быть использован для получения аморфного состояния биологических материалов, в том числе живых клеток. Способ позволяет проводить плавление аморфных образцов без их кристаллизации. Образец в диэлектрическом контейнере помещают в камеру высокого давления с жидкой диэлектрической средой, передающей гидростатическое давление на образец, при температуре ниже температуры кристаллизации T_к. Давление в камере поднимают до 100 атм и прикладывают к образцу вращающееся импульсное электрическое поле. Аморфный образец нагревают до температуры T_к, при которой начинается плавление аморфной структуры образца, при этом вращающееся импульсное электрическое поле препятствует формированию кристаллической структуры льда. При дальнейшем нагревании аморфного образца до положительных температур происходит его плавление без кристаллизации. 3 ил.

Способ замораживания водных растворов гелеобразующих биологических веществ до аморфного состояния и плавления аморфных образцов этих веществ путем охлаждения их в жидкой фазе под воздействием гидростатического давления выше атмосферного до температуры фазового превращения "жидкость гексанальный лед", затем уменьшения давления до атмосферного за время меньшее, чем время перемещения молекулы воды на межузельное расстояние в твердой кристаллической фазе, отличающийся тем, что на образцы дополнительно воздействуют вращающимся импульсным электрическим полем, а амфорные образцы этих веществ нагревают и плавят во вращающемся импульсном электрическом поле без их кристаллизации.