ШТАММ FLAVOBACTERIUM AQUATILE - ПРОДУЦЕНТ МАЛИНОВОГО ПИЩЕВОГО ПИГМЕНТА Российский патент 1999 года по МПК C09B61/00 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, винодельческой, консервной, кондитерской и парфюмерной промышленности. Пищевые красители относятся к числу добавок, усиливающих естественный цвет, присущий пищевым продуктам, различным товарам парфюмерной промышленности - лаки, губные помады и т.д. В пищевой промышленности возможность использования тех или иных красителей обусловлена не только природой пигментов, но также их реакцией на различные физические и химические воздействия (растворимость, влияние температуры, воздуха, света, изменения pH среды и т.д.).

Растительные пищевые красители (черная, красная смородина, клюква, клубника, рябина, калина, морковь, свекла, дыня и др.), объединенные под названием антоцианы, связаны с сезонностью их роста, длительностью обработки, наличием запаха и нежелательного привкуса.

Применяемые синтетические красители, минеральные пигменты имеют канцерогенное действие на организм человека, поэтому их использование в пищевых целях весьма нежелательно, а токсикологические исследования применяемых синтетических красителей приводят к значительному сокращению разрешенных красителей.

В настоящее время увеличение спроса на природные красители, причем наиболее дефицитными являются соединения, обеспечивающие пищевым продуктам, изделиям розовый, красный и фиолетовый оттенки, представляет практический интерес в различных отраслях.

В микробном мире широко распространены различные пигменты у грибов, актиномицетов, дрожжей, бактерий и водорослей, которые в отличие от высших растений культивируются в ферментерах в любое время года на недорогих субстратах, часто являющихся отходами той или иной пищевой отрасли.

Известен штамм гриба Penicillium rubrum - продуцент пигмента красного цвета (авт. свидетельство СССР N 1708820 МКИ⁵ C 09 B 61/00, C 12 N 1/14 Б.И. N 4 1992г. ). Недостатком известного штамма гриба является очень медленный рост культуры (5-6 суток). Известен штамм актиномицета Streptoverticillum hiroshimense ВКПМ S-804, используемый для производства красного пищевого красителя (авт. свидетельство СССР N 1701717 МКИ⁵ C 09 B 61/00 БИ N 48 1991г. ). Недостатком данного актиномицета является также медленный рост на богатой дорогостоящей питательной среде, более трудное отделение субстратного окрашенного мицелия при экстракции пигмента растворителями.

Наиболее близким по техническому решению и производственным показателям является непатогенный штамм гриба Blakeslea trispora - продуцент β-каротина и ликопина для пищевой и медицинской промышленности (ж. Прикладная биохимия и микробиология, 1996г. , том 32, N 5, стр. 545-548). Недостатками штамма гриба являются дорогостоящие добавки и их дефицитность для процесса циклизации - пиридин, имидазол, гордеин, никотин - для получения ликопина - предшественника β -каротина у штамма Blakeslea trispora. Процесс ферментации штамма гриба длится 115 часов, после чего биомассу гриба отфильтровывали и высушивали под вакуумом до постоянного веса. Содержание ликопина в мицелии определяли после экстракции ацетоном и н-гексаном спектрофотометрическим методом.

Технический результат заключается в получении нового штамма - продуцента дефицитного малинового пищевого пигмента на недорогостоящей минеральной среде, где в качестве источника углерода используется отход масложировой промышленности - топцитин-50 (смесь различных фосфолипидов - этерифицированных соединений глицерофосфорной кислоты), который соответствует требованиям законодательства по пищевым добавкам Европейского экономического сообщества Е 322 от 22 декабря 1981 года или глицерин при времени выращивания в периодическом асептическом режиме 18 часов и при высокой скорости протока среды Д = 0,25-0,3 час^-1. В качестве продуцента используется непатогенный мезофильный штамм Flavobacterium aquatile-409, который хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института ГосНИИгенетика под номером ВКПМ В-7429. Штамм выделен из природных субстратов - образца почв, пропитанного нефтепродуктами, вагонного депо г.Твери и селекционирован в периодическом и непрерывном асептическом процессе на минеральной среде с топцитином или глицерином.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Flavobacterium aquatile.

На мясо-пептонном агаре образует оранжево-красные круглые блестящие колонии, цельные или с двумя-тремя бороздками от центра, профиль колонии выпуклый, край гладкий, структура колонии однородная, диаметр 2-5 мм. Бактерии полиморфны, грамотрицательные, подвижные и слабоподвижные, бесспоровые, коккобациллы и палочки одиночные или сдвоенные, размер клеток: 1,4х1,05, 2,45х1,05, 2,1х1,05, 1,4х1,4, 1,05х1,05, 1,75х1,4 мкн, образуют кислоты из глюкозы, сахарозы, мальтозы, наблюдается свертывание и пептонизация молока, восстанавливает лакмусовое молоко, послойное разжижение желатины, розовый пигмент в МПБ, обильный рост на ломтике картофеля с ярко- оранжево-красным пигментом, каталаза положительная, индол и сероводород не образует. Хорошо растет в диапазоне pH среды 6,8-7,0 при температуре 15-30^o, оптимум 26-28^o. Штамм непатогенен и фагоустойчив, хемоорганотроф. Содержание Г+Ц в ДНК равно 33 мол%. Культура хранится в сублимационно высушенном состоянии и на косяках с гидролизатом казеина - 20 г, KH₂PO₄ - 6,5 г, (NH₄)₂SO₄ - 3 г, MgSO₄ - 0,7 г, микроэлементы: FeSO₄•7H₂O, ZnSO₄•7H₂O, MnSO₄•5H₂O по 12,5 мг, растворяются в одном литре воды, добавляют 15 г агар-агара и стерилизуется при 1 атм 30 минут. После выращивания в термостате при температуре 26-28^oC, хранится в комнатных условиях при температуре 20-22^oС. Штамм устойчив к антибиотикам, данные представлены в таблице.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Периодическое культивирование штамма Flavobacterium aquatile ВКПМ В-7429 проведено в качалочных колбах объемом 750 мл при 220 об/мин при температуре 26-28^oC. Для засева используется односуточная культура путем смыва косяка стерильной водой в минеральную среду следующего состава: (NH₄)₂SO₄ - 3 г/л, KH₂PO₄ - 6,5 г/л, MgSO₄ - 0,7 г/л, м/э FeSO₄•7H₂O, ZnSO₄•7H₂O, MnSO₄•5H₂O по 12,5 мг/л, 0,05% дрожжевого автолизата, pH - 6,8-7,0. Засев производился по плотности 0,1 единиц.

В качестве источника углерода использовали отходы жировой промышленности - топцитин-50 в концентрации 2% вес. следующего состава: фосфолипиды - 60%, фосфор - 2,0%, вещества, растворимые в толуоле - 0,3%, кислотное число - 5,0%, влажность - 0,8%, вязкость (при 25^oC) - 12,5 ПА/с, цветное число на йодной шкале - 60 или глицерин в концентрации 2% весовых. Культивирование проведено в течение 18 часов до конца логарифмической фазы роста, когда полностью заканчивается накопление пигмента, а концентрация биомассы достигла на топцитине - 5 г АСБ/л, на глицерине - 4,2 г АСВ/л. Экстракцию пищевого малинового пигмента производили этилацетатом, предварительно подкислив инокулят 10% серной кислотой до pH=2,0 ед, затем колбу нагревают при температуре 90^oC в течение 10-15 минут. Этилацетат целиком извлекает пигмент из культуральной жидкости и на 2/3 из выросшей пигментированной биомассы. В делительной воронке отделяют пигмент, переносят в роторный испаритель перегонную колбу, растворитель отгоняют при температуре 75^oС, а концентрированный пигмент переносят из приемной колбы небольшим количеством растворителя в широкий бюкс и оставляют до утра под тягой. Концентрация пигмента с одного литра среды составила 1,5 г, что на 50% выше по сравнению с прототипом. Потери растворителя при отгонке составляют 6%. В отличие от прототипа экстракцию пигмента можно проводить без стадии отделения биомассы от культуральной жидкости и без сушки под вакуумом выросшей в течение 155 часов биомассы гриба Blakeslea trispora, что удешевляет технологический процесс получения пищевого пигмента и ускоряет в 8 раз процесс ферментации предлагаемого штамма Flavobacterium aquatile ВКПМ В-7429 - продуцента малинового пищевого пигмента.

Пример 2. Периодическое асептическое культивирование штамма Flavobacterium aquatile ВКПМ В-7429 проводят в 10-литровом японском ферментере "Марубиши" с автоматическим поддержанием температуры 26-28^oС, pH - 6,8-7,0 и подтитровкой 10% щелочью на минеральной питательной среде, указанной в примере 1. Засевной материал в концентрации 5% к объему ферментера готовили в качалочных колбах, в качестве источника углерода использовали топцитин-50 или глицерин в концентрации 2% вес. После ферментации, в течение 20 часов, среду подкисляли и проводили экстракцию в том же аппарате. Концентрированный пигмент отгоняли в лабораторных условиях согласно примеру 1.

Таким образом, предлагается новый штамм - продуцент пищевого малинового пигмента Flavobakterium aquatile, который в отличие от прототипа синтезирует его за более короткий срок (18-20 часов против 155 часов) без внесения дорогостоящих дефицитных добавок, таких как, например, пиридина, имидазола, гордеина, никотина и других веществ, для процесса циклизации необходимого для мукорового гриба Blaceslia trispora, где фиолетовый пигмент ликопин является предшественником бета-каротина. При получении пищевого малинового пигмента у штамма Flavobacterium aquatile в лабораторных и камеральных условиях сокращаются две энергоемкие технологические стадии: сепарация и сушка. На стадии экстракции малинового пигмента у Flavobacterium aquatile возможен практически полный возврат более дешевого растворителя - этилацетата в производство, в то время как у прототипа используется более дорогой комплексный растворитель: н-гексан и ацетон, регенерация которого осуществляется с меньшим выходом. Концентрация конечного пигмента на 50% выше, чем у прототипа (1,5 г/л против 1 г/л у Blakeslea trispora).

Изобретение предназначено для использования в биотехнологии, пищевой, винодельческой, консервной, кондитерской и парфюмерной промышленности. Штамм Flavobacterium aquatile ВКПМ В-7429 - продуцент малинового пищевого пигмента, обеспечивающий высокую скорость синтеза целевого продукта при управляемом периодическом асептическом культивировании на недорогих субстратах. Использование данного продуцента позволяет упростить технологию выделения продукта и применить в ней растворитель с более высокой степенью регенерации. 1 табл.

Штамм Flavobacterium aquatile ВКПМ В-7429-продуцент малинового пищевого пигмента.