СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОГО БАЛАНСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/48 G01N33/497 G01N33/52 

Антиокислительный баланс - важнейшая сторона функционального гомеостаза организма человека, характеризующаяся показателями уровня радикалообразования и способности к инактивации их повреждающего действия (супероксидперехватывающей активности - СПА).

Изобретение относится к области клинической биохимии, гигиены и может быть использовано для оценки антиокислительного статуса (АОС) организма у различных контингентов населения.

Целью изобретения является повышение точности оценки антиокислительного баланса для характеристики общего функционального состояния организма.

Способ включает сбор конденсата альвеолярной влаги (экспирата) в модернизированный поглотитель Полежаева, определение максимальных величин хемилюминесценции образца - спонтанной (Исп) и H₂O₂- индуцированной (И), расчет индекса активации А=И/Исп, характеризующего интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления (СРО), определение времени достижения максимального сигнала ХЛ ( T₁) и времени спада его на половину (T₂), расчета отношения T=T₁/T₂, отражающего степень антирадикальной защиты, устанавление коэффициента К= Т/А, значения которого, меньшие 1, свидетельствуют о нарушении антиокислительного баланса и отклонениях в общем функциональном состоянии организма.

Известен способ определения супероксидной активности выдыхаемого воздуха у больных и здоровых людей путем сбора у исследуемого человека выдыхаемого воздуха в герметичный полиэтиленовый мешок, инкубирования стандартного объема испытуемого воздуха с нитросиним тетразолиевым в присутствии супероксиддисмутазы и для контроля - с альбумином, экстрагирования смесью диметилсульфоксидхлороформ продуктов взаимодействия супероксидного анионрадикала и нитросинего тетразолия - формазанов, спектрометрического определения их оптической плотности, расчета концентрации формазанов на стандартный объем испытуемого выдыхаемого воздуха, вычисления и оценки разности содержания супероксидрадикала в исследуемом воздухе пациента и здорового человека, которая характеризует супероксидную активность в исследуемом воздухе /1/.

Недостатком способа является возможность оценки только одной из сторон АОС - супероксидной активности, что не позволяет сделать полный вывод о состоянии антиокислительного баланса.

Известен способ оценки функционального состояния организма горнорабочих на основании исследования двух составляющих АОС путем отбора конденсата альвеолярной влаги в модернизированный поглотитель Полежаева, определения в образце супероксидперехватывающей активности методом спектрофотометрии, основанным на ингибировании нитросинего тетразолиевого в системе генерации супероксидных анион-радикалов в биологическом материале при последовательном внесении в кювету спектрофотометра 1,3 мл буферной смеси из однозамещенного фосфата калия и гидроокиси натрия, 0,4 мл исследуемой пробы, 0,5 мл раствора никотинамид-аденин-динуклеотида восстановленного, 0,3 мл раствора тетразолиевого-п-нитросинего и, после быстрого перемешивания, 0,1 мл раствора феназин метасульфата, а также определения интенсивности Н₂O₂-индуцированной ХЛ по светосумме сигнала (S) с использованием биолюминометра при последоваительном внесении в его кювету 1 мл фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), 50 мкл 0,006%-ного раствора люминола (рН 7,3-7,4), исследуемого конденсата в объеме 0,2 мл, введении 0,2 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода и немедленном измерении показаний интенсивности свечения в течение 1-2 минут, нахождения коэффициента соотношения S/СПА и оценки функционального состояния организма как преморбидного при возрастании полученного коэффициента в сравнении с нормой /2/.

Недостатками способа являются его сложность и длительность, обусловленные необходимостью выполнения двух разноплановых исследований биопробы (биохимического и биофизического) для характеристики двух сторон свободнорадикального окисления - радикалообразования и антирадикальной защиты.

Наиболее близким по технической сущности является способ неинвазивной диагностики функционального состояния организма горнорабочих Крайнего Севера при воздействии комплекса производственных факторов /3/ путем сбора экспирата в модернизированный поглотитель Полежаева, помещенный в емкость со смесью льда и NaCl для конденсации, определения интенсивности радикалообразования (ИР) по светосумме (S) сигнала люминолзависимой Н₂O₂-индуцируемой ХЛ при последовательном внесении в кювету 1 мл фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), 50 мкл 0,006%-ного раствора люминола (рН 7,3-7,4), конденсата в объеме 0,2 мл, введении 0,2 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода и немедленном измерении показаний интенсивности свечения в течение 1-2 минут, нахождения коэффициента общей резистентности S/СПА на основании эмпирической зависимости S/СПА от S и диагностики отклонений в функциональном состоянии организма при возрастании полученного коэффициента в сравнении с нормой (50-150%).

Недостатком способа является его неточность, связанная с тем, что при данном способе реально определяется показатель только одной стороны СРО - интенсивность радикалообразования, в то время как другая сторона - супероксидперехватывающая активность, оценивается с использованием эмпирической зависимости между двумя этими показателями.

Целью изобретения является повышение точности оценки антиокислительного баланса для характеристики общего функционального состояния организма.

Цель достигается путем сбора 1 мл экспирата в модернизированный поглотитель Полежаева, помещенный в емкость со смесью льда и NaCl для конденсации, проведения ХЛ исследования пробы при последовательном внесении в кювету хемилюминометра 1 мл фосфатного буфера (рН 7,3-7,4), 50 мкл 0,006%-ного раствора люминола (рН 7,3-7,4), образца биопробы в объеме 0,2 мл, введении 0,2 мл свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода и немедленном измерении показаний интенсивности свечения в течение 1-2 минут, регистрации максимальной интенсивности спонтанной (Исп) и Н₂O₂-индуцированной ХЛ (И), расчета индекса активации А=И/Исп, определения времени достижения максимального сигнала ХЛ (T₁) и спада его до половины (Т₂), расчета отношения T= T₁/T₂, установления коэффициента К=Т/А, выход которого за пределы границы физиологического равновесия (1,0) свидетельствует о нарушении антиокислительного баланса и отклонениях в общем функциональном состоянии организма.

Отличительные особенности способа состоят в том, что две стороны СРО - радикалообразование и антирадикальная защита, оценивают путем одного ХЛ - исследования биологической пробы - экспирата, при этом для характеристики интенсивности радикалообразования определяют индекс активации (А), для характеристики антирадикальной защиты - отношение времени достижения максимального сигнала ХЛ к времени спада его до половины (Т), а нарушение антиокислительного баланса констатируют при выходе значений К=Т/А за пределы функциональной нормы (1,0).

Способ позволяет устанавливать индивидуальные отклонения в антиокислительном балансе, может быть применен при обследовании различных контингентов взрослого и детского населения.

В сравнении со способом прототипа предлагаемый способ является более точным, так как оценка отношения двух сторон СРО базируется на реально определенных данных о формировании кривой индуцированной ХЛ в экспирате, что существенно при проведении мониторинговых и скрининговых исследований.

Применение способа иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕРЫ ВЫПОЛНЕНИЯ СПОСОБА
Пример 1
В результате проведенного гигиенического анализа состояния структуры питания в одном из детских дошкольных учреждений было отмечено невыполнение норм потребления ряда важнейших продктов, что позволило оценить характер питания как несбалансированный.

Для оценки АОС у ребенка 6 лет, посещающего этот детский сад, в течение 20 минут при нефорсированном дыжании был собран 1,0 мл экспирата в модернизированный поглотитель Полежаева, помещенный в смесь льда с хлористым натрием для конденсации.

В отобранной биопробе проведено определение параметров спонтанной и индуцированной ХЛ с помощью хемилюминометра ПХЛ-01. Для этого в термостатируемую камеру прибора помещали кювету с 1 мл буферного раствора и 50 мкл раствора люминола, добавляли 0,2 мл исследуемой пробы, измеряли величину спонтанной ХЛ ( при непрерывном перемешивании) - Исп, затем вводили 0,2 мл раствора перекиси водорода в качестве активирующего агента и регистрировали изменения интенсивности индуцированной ХЛ в течение 2-3 минут. При проведении холостых измерений вместо исследуемой пробы в кювету вносили аналогичное количество буферного раствора.

По полученным данным построили зависимость интенсивности сигнала (И) от времени, из которой определили следующие параметры в относительных единицах по отношению к аналогичным параметрам для холостой пробы:
- интенсивность спонтанной ХЛ (Исп) - 1,05;
- максимальную интенсивность индуцированного свечения (И) - 5,73;
- время достижения максимальной интенсивности ХЛ (T₁) - 1,0;
- время спада интенсивности до половины максимального значения (Т₂) - 0,87.

После этого рассчитали индекс активации А=И/Исп, который составил 5,46, отношение времени достижения максимального сигнала к времени спада Т=Т1/Т2, что составило 1,15 и коэффициент К=Т/А, который в этом случае оказался равным 0,21, что меньше 1,0. Таким образом, у данного ребенка было констатировано нарушение АО баланса.

Для сравнения со способом прототипа в той же пробе провели измерение светосуммы сигнала Н₂O₂ - индуцированной ХЛ при внесении в кювету хемолюминометра 1 мл буферного раствора, 50 мкл раствора люминола, 0,2 мл исследуемой пробы, 0,2 мл раствора перекиси водорода в качестве активирующего агента и регистрации изменения интенсивности индуцированной ХЛ в течение 2-3 минут. Светосумму определяли как площадь под кривой ХЛ. При проведении холостых измерений вместо исследуемой пробы в кювету вносили аналогичное количество буферного раствора. Показания значений светосуммы рассчитывали в процентах к светосумме сигнала индуцированной ХЛ для холостой пробы.

Коэффициент резистентности выводили в соответствии с эмпирическими формулами /2/ в зависимости от значений светосуммы. В рассматриваемом примере значение светосуммы (S) составило 265,98%, коэффициента общей резистентности - 292,16%, что выходит за границы физиологической нормы, установленной в интервалах 50-150% и позволяет отметить факт нарушения функционального состояния организма у обследованного ребенка, установленный по наличию отклонений в АОС.

По результатам обследования ребенку был назначен и проведен комплекс лечебно-профилактических мероприятий, включающий антиоксидантную терапию, после чего исследования антиоксидантного баланса были повторены и показали, что интенсивность радикалообразования снизилась (А=1,77), супероксидная активность увеличилась (Т= 1,82), что привело к сбалансированию АОС (К=1,03). Оценка по показателю светосуммы ХЛ показала, что ее значения также снизились до 97,7% и определенный по эмпирической формуле коэффициент общей резистентности составил 98%, что не выходит за границы физиологической нормы.

Таким образом, оценка антиокислительного баланса у ребенка, проведенная двумя способами путем исследования экспирата, позволила сделать одинаковые заключения, но в предлагаемом способе выводы опираются на реально полученные данные о состоянии свободнорадикального окисления в изучаемой биосреде на момент исследования, в то время как способ прототипа использует ранее установленные эмпирические зависимости, полученные при обобщении данных большого контингента обследованных, что снижает точность и достоверность результатов.

Пример 2
Для оценки функционального состояния организма у рабочих металлургического предприятия выбрана однородная группа мужчин в возрасте 20-28 лет со стажем работы не менее 5 лет численностью 16 человек.

В воздухе рабочей зоны было установлено, помимо других факторов, наличие комплекса тяжелых металлов в концентрациях, близких к ПДК.

В отобранном у каждого из обследованных экспирате проведена оценка антиокислительного баланса двумя методами - предлагаемым и по способу прототипа с усреднением полученных результатов в целом по группе. Исследования, проведенные так же, как и примере 1, показали, что интенсивность радикалообразования (А) составила 1,22, супероксидперехватывающая активность, характеризуемая показателем Т - 0,41 и коэффициент К - 0,42. Низкое значение К указывает на нарушение антиокислительного баланса и является основанием для проведения курса антиоксидантной профилактики. Оценка по способу прототипа показала, что среднее значение показателя общей резистентности составило 352%, что совпадает с оценкой по предлагаемому способу и подтверждает сделанные выводы.

После проведения курса антиоксидантной терапии в той же группе провели повторные обследования, из которых видно, что антиокислительный баланс выравнялся: А=1,26; Т=1,36; К=1,08. Интенсивность радикалообразования, оцененная по светосумме сигнала, составила 115,5% и показатель общей резистентности 1,15, что в пределах физиологической нормы.

Таким образом, как и в примере 1, предлагаемый способ позволил достаточно быстро и просто провести адекватную оценку антиокислительного баланса для характеристики общего функционального состояния, не прибегая к использованию эмпирических закономерностей.

Список литературы
1. Способ определения супероксидной активности выдыхаемого воздуха больных и здоровых людей. Патент RU 2128338 С1.

2. Способ оценки функционального состояния организма горнорабочих. Патент SU 1811608 A3.

3. Неинвазивная диагностика функционального состояния организма горнорабочих Крайнего Севера при воздействии комплекса производственных факторов, профилактические мероприятия. Методические рекомендации.-М.,1992.-28 с.

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической биохимии, гигиене, и может быть использовано для оценки антиокислительного статуса организма у различных контингентов населения. Способ включает сбор конденсата альвеолярной влаги, затем определяют максимальную величину интенсивности Н₂O₂-индуцированной хемилюминесценции (И), максимальную величину спонтанной хемилюминесценции (Исп), рассчитывают индекс активации А=И/Исп, устанавливают время достижения максимальной величины хемилюминесценции T₁ и время ее спада на половину - Т₂, рассчитывают отношение Т=T₁/ Т₂ и коэффициент К=Т/А, и при значении К<1 определяют нарушение антиокислительного баланса. Технический результат - повышение точности оценки антиокислительного баланса для характеристики общего функционального состояния организма.

Способ оценки антиокислительного баланса организма человека, включающий сбор конденсата альвеолярной влаги, определение величины интенсивности Н₂О₂ - индуцированной хемилюминесценции образца, отличающийся тем, что определяют максимальную величину интенсивности Н₂О₂ - индуцированной хемилюминесценции (И), максимальную величину спонтанной хемилюминесценции (Исп), рассчитывают индекс активации А= И/Исп, устанавливают время достижения максимальной величины хемилюминесценции T₁ и время ее спада на половину - Т₂, рассчитывают отношение Т= T₁/Т₂ и коэффициент К=Т/А, и при значении К<1 определяют нарушение антиокислительного баланса.