СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ОСТРОГО РАДИОАКТИВНОГО ЗАРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к радиобиологии и медицине.

Известен способ выявления радиоактивного заражения организма с помощью дозиметрического контроля выделений человека и животных, их биологических жидкостей и тканей, в том числе и крови (БМЭ, т. 7, с. 430-431, 1977).

Недостатками дозиметрического контроля являются необходимость специальной дорогостоящей аппаратуры, квалифицированного персонала.

Изобретение направлено на решение задачи: упрощение способа при высокой специфичности и чувствительности.

Указанная задача достигается путем определения в периферической крови числа лимфоцитов, взаимодействующих с эритроцитами барана, сенсибилизированными хлоридом стронция, через 30 мин после попадания нуклида в организм и при повышении числа стронциевых розеткообразующих лимфоцитов свыше 10% выявляют острое радиоактивное заражение организма.

Способ осуществляют следующим образом:
забирают 3 мл венозной крови в центрифужную пробирку с 1,5 мл 5%-ного свежеприготовленного раствора цитрата натрия для предупреждения свертывания крови. Смесь тщательно встряхивают и оставляют на 60 мин при комнатной температуре для получения лейкоцитарной взвеси. После отстаивания крови забирают 0,4 мл лейкоцитарной взвеси в другую пробирку. Для лизирования эритроцитов в пробирку добавляют 3 мл дистиллированной воды. Взвесь тщательно, но осторожно перемешивают. Через 20 с добавляют 3 мл 1,8%-ного раствора натрия хлорида. Взвесь перемешивают и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Сливают надосадочную жидкость и добавляют 1 мл среды 199, оставляют пробирку на 15 мин в термостате при 37^oC. После инкубации смесь центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 0,1 мл среды 199 и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Затем в пробирку вносят 0,1 мл стронциевого эритроцитарного диагностикума. Смесь клеток инкубируют в течение 15 мин в термостате при 37^oC. После инкубации ее центрифугируют в прежнем режиме и оставляют на 1 ч в холодильнике при 4^oC. После инкубации стягивают надосадочную жидкость. Остаток осторожно пипетируют. К осадку добавляют 0,05 мл (одна капля) 0,5%-ного раствора глютарового альдегида, встряхивают и выдерживают 14 мин при комнатной температуре. С целью отмывания клеток от глютарового альдегида в пробирку вносят 0,75 мл дистиллированной воды и смесь центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин. Стянув недостаточную жидкость, к осадку добавляют 0,5 мл бычьей сыворотки. После центрифугирования смеси при 1500 об./мин в течение 5 мин сливают надосадочную жидкость, а осадок осторожно пипетируют. Делают из осадка мазок, высушивают на воздухе, фиксируют в течение 30 мин в этиловом спирте и окрашивают по Романовскому-Гимзе. При 900-кратном увеличении микроскопируют мазок, просматривают 100 лимфоцитов, отмечая среди них число фиксировавших на своей поверхности 3 и более бараньих эритроцитов. При наличии среди 100 клеток более 10% розеткообразующих (РОК) диагностируют наличие в организме повышенного содержания стабильного нуклида - свидетеля острого радиоактивного заражения организма.

Для приготовления диагностикума используют глютаризированные эритроциты барана. Обработку эритроцитов барана глютаровым альдегидом производят, соединяя 0,5 мл 5%-ной взвеси тщательно отмытых свежих эритроцитов с 0,25%-ным свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1. Смесь выдерживают при 37^oC в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от альдегида забуферанным изотоническим раствором хлорида натрия (pH 7,2) и доводят этим же раствором до первоначального объема (5%-ная взвесь). Сенсибилизацию глютаризированных эритроцитов хлоридом стронция производят, растворяя 2 мг хлорида стронция в 0,5 мл фосфатного буферного раствора (pH 6,4). Берут 0,1 мл 5%-ной взвеси глютаризированных эритроцитов барана центрифугируют при 1500 об. /мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, эритроциты дважды отмывают фосфатным буферным раствором (pH 6,4) и доводят взвесь до 0,5 мл этим же буфером. Соединяют отмытые эритроциты с раствором хлорида стронция в соотношении 1:1. Смесь тщательно встряхивают и выдерживают в течение 30 мин при 37^oC, периодически встряхивая. После инкубации в термостате эритроциты дважды отмывают фосфатным буферным раствором (pH 7,2) и этим же буфером доводят взвесь до первоначального объема (0,1 мл). При постановке заявленного способа используют 0,5%-ную взвесь "стронциевых" эритроцитов, готовя ее их 5%-ной взвеси, соединяя 0,1 мл 5%-ной взвеси с 0,9 мл среды 199.

Полученные результаты представлены в табл.1.

При проверке чувствительности заявляемого способа установлена его высокая чувствительность (табл. 2).

Пример 1. Крысу-самца массой 164 г декапитировали. Взяли 3 мл крови в пробирку с 1,5 мл 5%-ного раствора цитрата натрия. Встряхнув пробирку, дали крови отстояться при комнатной температуре в течение 1 ч. Через час забрали 0,4 мл лейкоцитарной взвеси. Эритроциты лизировали в ней путем добавления 3 мл дистиллированной воды. Через 20 с добавили к взвеси 3 мл 1,8%-ного раствора хлорида натрия и центрифугировали ее в течение 5 мин при 1500 об. /мин. После удаления насадочной жидкости осадок отмыли средой 199 и ресуспендировали в 0,1 мл среды 199. Соединили осадок лейкоцитов с 0,1 мл стронциевого эритроцитарного диагностикума. После инкубации смеси в течение 15 мин при 37^oC и в течение 1 ч при 4^oC центрифугировали смесь клеток. Образовавшиеся розетки фиксировали глютаровым альдегидом, который удаляли, в последующем отмывая клетки дистиллированной водой. Выдержав осадок в бычьей сыворотке, делали мазок, высушивали его на воздухе, фиксировали этаноловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Просматривали под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая среди них количество лимфоцитов, фиксировавших на своей мембране три и более бараньих эритроцита.

Заключение: в результате проведенного исследования в крови крысы обнаружено 2% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных хлориду стронция, что отрицает наличие повышенного содержания нуклида в организме крысы и свидетельствует об отсутствии радиоактивного заражения данного животного.

Пример 2. Крысе-самцу массой 172 г ввели внутримышечно 0,5 мл 0,4%-ного раствора хлорида стронция. Через 30 мин крысу декапитировали и забрали кровь в цитрат натрия. Получили лейкоцитарную взвесь, отработали ее описанным образом. Затем соединили со стронциевым эритроцитарным диагностикумом и проделали все последующие этапы заявляемого способа.

Заключение: в результате исследования в крови животного обнаружено 25% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных стронцию. Эти данные говорят о повышенном содержании хлорида стронция в организме крысы и, следовательно, о наличии острого радиоактивного заражения данного животного.

Пример 3. Крысу-самца массой 160 г декапитировали, взяв кровь в свежеприготовленный раствор цитрата натрия. Получив лейкоцитарную взвесь, обработали ее описанным образом, соединили с эритроцитарным диагностикумом. Проведя все этапы исследования, обнаружили в крови животного 10% розеткообразующих лимфоцитов, специфичных хлориду стронция.

Заключение: полученный результат отрицает наличие повышенного содержания нуклида в крови животного и свидетельствует об отсутствии радиоактивного заражения крысы.

Положительный эффект: заявленный способ технически прост и быстр в осуществлении, высокочувствителен, специфичен, позволяет рано (практически немедленно) диагностировать острое радиоактивное заражения организма, может осуществляться клинической лабораторией, используется безопасный стабильный нуклид, который, попав в организм, распределяется в его внутренних средах аналогично радиоактивному.

Сущность: cпособ может быть использован в медицине, в частности в радиобиологии. Способ позволяет упростить методику выявления острого радиоактивного заражения организма при высокой специфичности и чувствительности. В периферической крови определяют число лимфоцитов, взаимодействующих с эритроцитами барана, сенсибилизированными хлоридом стронция, через 30 мин после попадания нуклида в организм. При повышении числа стронциевых розеткообразующих лимфоцитов свыше 10% выявляют острое радиоактивное заражение организма. 2 табл.

Способ выявления острого радиоактивного заражения организма путем исследования периферичевской крови, отличающийся тем, что в крови определяют число лимфоцитов, взаимодействующих с эритроцитами барана, сенсибилизированными хлоридом стронция, и при повышении числа стронциевых розеткообразующих лимфоцитов свыше 10% выявляют острое радиоактивное заражение организма.