СРЕДСТВО ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к диагностике заражения бруцеллезом, и может быть использовано в медицине и ветеринарии. Для диагностики бруцеллеза человека и животных существуют ряд антигенов. Так, например, в медицине используют Хедельсона, который имеет тенденцию к неспецифическим реакциям. В животноводстве применяется единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК (пробирочный метод) и роз бенгал-антиген (капельный метод). Все существующие антигены выявляют вакцинированных и спонтанно зараженных бруцеллезом, дифференцируя их, они малоспецифичны, слабо чувствительны, трудоемки, а также предназначены для постановки реакции только на сыворотке крови.

Наиболее близким к заявленному методу является диагностическое средство для выявления бруцеллеза, содержащее убитые бруцеллезные клетки в фенолизированном физиологическом растворе [1].

Учитывая все недостатки существующих диагностикумов, а также отсутствие средств для дифференцированной диагностики вакцинированных и зараженных особей, нами разработано средство и способ его получения, который отвечали бы современным требованиям практической вирусологии. Разработанное нами диагностическое средство может быть с успехом использовано как в работе с сывороткой крови, так и цельной крови, а также молоком.

Основой для нового диагностического средства служит единый бруцеллезный антиген [1], выпускаемый отечественными биофабриками. Первоначальный уровень микробных тел, содержащихся в указанном антигене,доводят до количества 13 - 14 млрд./см³, далее вносят 10%-ный раствор фенола, встряхивают смесь и оставляют на 5-6 ч. После этого в смесь по каплям добавляют концентрированную серную кислоту, предварительно разбавленную дистиллированной водой в соотношении 1 : 10, встряхивают в течение 4 - 5 мин и оставляют смесь на 4 - 5 дней, по истечении указанного времени препарат готов к применению.

Препарат, применяемый для диагностики, содержит в конечной концентрации следующие компоненты (на 100 мл антигена):
Фенол 10%-ный - 0,5 - 0,6 мл
Концентрированная серная кислота - 0,6 - 0,8 мл
Данное диагностическое средство используют для выявления бруцеллеза пластинчатым (капельным) методом).

Диагностику с помощью полученного средства осуществляют следующим образом.

На стекло наносят 0,03 мл сыворотки и сверху 0,025 мл средства, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. После чего покачивают вращательными движениями в течение 5 мин и учитывают результат реакции. Для ускорения реакции лучше после перемешивания смесь нагревать до 37 - 40 ^oC. В этом случае результат выявляется в течение 3 мин. При положительной реакции на бруцеллез образуются агглютинины в виде мелких или крупных хлопьев, а при отрицательной - смесь остается гомогенной, в том числе и для вакцинированных животных.

Способы постановки реакций на крови и молоке аналогичны способу постановки на сыворотке.

Контролем служит биофабричная положительная гиперимунная сыворотка, разведенная 1 : 1 физиологическим раствором. Целью проверки специфичности и чувствительности антигена берется 0,03 мл гиперимунной сыворотки и 0,05 мл антигена, после смешивания и вращательного движения в течение 3 мин учитывается результат реакции. При положительной реакции образуются крупные или мелкие агглютинины в виде хлопьев.

Предлагаемый антиген по своей чувствительности и специфичности позволяет определить титр антител в сыворотке крови капельным методом. Для этого на стекло наносится 0,03; 0,02; 0,01; 0,005; 0,0025 мл, положительно реагирующей на бруцеллез сыворотки, и сверху на них наносится 0,025 мл антигена. После тщательного перемешивания (которое начинаем с малого титра) нагреваем над пламенем спиртовки до 37-40^oC и путем вращательного движения в течение 5 мин учитываем результаты реакции. Агглютинация в смеси 0,03 - 0,025 соответствует титру 1 : 100, 0,02 - 0,025 - 1 : 200 и т.д.

Главным преимуществом средства является возможность использования его для постановки реакций на цельной крови. Наши исследования убедительно показали, что при использовании только сыворотки около 30 - 40% антител остаются в сгустке крови, тем самым не позволяют выявить заболевание на ранней стадии.

Данный метод дает возможность путем ревакцинаций избавиться от заболеваний бруцеллезом человека и животных, который приносит моральный и материальный ущерб человечеству и животноводству.

Способ приготовления дифференциального антигена прост, не требует дополнительных вложений и изменений в технологии производства биофабрик. Для постановки реакций не требуется термостатов и холодильников.

Средство предназначено для дифференциальной диагностики бруцеллеза методом постановки реакции взаимодействия антиген-антитело. Средство для дифференциальной диагностики бруцеллеза содержит клетки бруцелл в физиологическом растворе, фенол и дополнительно серную кислоту. Указанные компоненты средство содержит при следующем соотношении (на 100 мл физиологического раствора с содержанием убитых клеток 13 - 14 млрд/мл): 10%-ный раствор фенола 0,5 - 0,6 мл, 8 - 12%-ный раствор серной кислоты 0,6 - 0,8 мл. Для получения средства для дифференциальной диагностики бруцеллеза проводят концентрирование убитых клеток до содержания 13 - 14 млрд. на 1 мл физиологического раствора. Далее на 100 мл полученного раствора вносят 0,5 - 0,6 мл 10%-ного раствора фенола. Смесь встряхивают и инкубируют в течение 5 - 6 ч. Затем к смеси добавляют по каплям 0,6 - 0,8 мл 8 - 12%-ного раствора серной кислоты, встряхивают в течение 4 - 5 мин и выдерживают в течение 4 - 5 сут при комнатной температуре. Полученное средство позволяет проводить дифференцированную диагностику зараженных животных, может быть использовано для постановки реакции в пробе цельной крови. 2 с.п. ф-лы.

1. Средство для дифференциальной диагностики бруцеллеза методом постановки реакции взаимодействия антиген антитело, содержащее убитые клетки бруцелл в физиологическом растворе и фенол, отличающееся тем, что средство дополнительно содержит серную кислоту при следующем соотношении компонентов (на 100 мл физиологического раствора с содержанием убитых клеток 13-14 млрд/м): 10% -ный раствор фенола 0,5 0,6 мл, 8-12%-ный раствор серной кислоты 0,6 0,8 мл. 2. Способ получения средства для дифференциальной диагностики бруцеллеза, включающий добавление фенола в физиологический раствор, содержащий убитые клетки бруцелл, отличающийся тем, что проводят концентрирование убитых клеток до содержания 13 14 млрд на 1 мл физиологического раствора, далее на 100 мл полученного раствора вносят 0,5 0,6 мл 10%-ного раствора фенола, смесь встряхивают и инкубируют в течение 5 6 ч, затем к смеси добавляют по каплям 0,6 0,8 мл 8 12%-ного раствора серной кислоты, встряхивают в течение 4 5 мин и выдерживают в течение 4 5 сут при комнатной температуре.