СПОСОБ СНИЖЕНИЯ СЕРОПОЗИТИВНОСТИ ЖИВЫХ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИН ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для профилактики бруцеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных.

Бруцеллез - инфекционное заболевание, поражающее различные виды животных и человека. Заболевание передается только от животного к человеку или от животного к животному. Заболевание бруцеллезом наносит существенный экономический ущерб животноводству, так как вызывает уменьшение продуктивности, снижение жизнеспособности приплода, а проводимые ветеринарно-санитарные мероприятия требуют значительных материальных затрат.

Ущерб, причиняемый бруцеллезом, усугубляется заболеванием людей, которое ведет к потере трудоспособности и часто к пожизненной инвалидности.

Для профилактики бруцеллеза в настоящее время широко используют живые вакцины из штаммов, находящихся в стабильной S-форме, - В.abortus 19, B.melitensis Rev-1, которые служат эталоном при разработке других бруцеллезных вакцин.

Все применяемые вакцины из штаммов, находящихся в S-форме, имеют выраженные антигенные свойства и стимулируют продолжительный иммунитет (8-24 месяца). Однако их иммуногенность находится в прямой зависимости от остаточной вирулентности и приживаемости. Данные вакцины имеют выраженную серопозитивность, т.е. способность индуцировать специфические бруцеллезные антитела, которые длительно присутствуют в крови вакцинированных животных. Выявление больных животных основано на выявлении бруцеллезных антител в крови. В результате вакцинации в течение длительного времени затрудняется дифференциация вакцинированных животных от инфицированных.

Несмотря на целый ряд предложений, в настоящее время в ранние сроки после вакцинации невозможно отличать привитых животных от больных бруцеллезом.

Известны также способы снижения уровня серопозитивности за счет применения убитых вакцин (KB 17/100), живых вакцин из RS-штаммов бруцелл (из штамма 82, 75/79-АВ), вакцин на основе антигенов, выделенных из клеток бруцелл (бруцеллезная химическая вакцина). Данные вакцины наряду со сниженной серопозитивностью обладают слабой иммуногенностью (вакцины из убитых штаммов бруцелл и из антигенов), живые вакцины, полученные из RS-штаммов, обладают нестабильными свойствами и часто переходят в S-форму, что еще сильнее мешает дифференциальной диагностике (1, 2).

Наиболее близким способом, который можно принять за прототип, является использование вакцины из штамма 19 в малых дозах - 3 млрд. микробных клеток (3).

Использование вакцины из штамма 19 в малой дозе 3 млрд. микробных клеток также вызывает образование и длительную персистенцию специфических бруцеллезных антител, затрудняющих дифференцировку больных и вакцинированных животных, а дальнейшее уменьшение вакцинирующей дозы снижает ее иммуногенную активность.

Таким образом, применение уменьшенных доз вакцины полностью не решает проблему профилактической вакцинации и дифференциации вакцинированных животных от больных.

Задачей наших исследований является снижение негативных последствий (длительной серопозитивности) вакцинации домашних животных живыми противобруцеллезными вакцинами, мешающих дифференциации инфицированных и вакцинированных животных существующими коммерческими диагностикумами при проведении оздоровления хозяйств от бруцеллезной инфекции.

Техническим результатом является снижение титров специфических антител вплоть до недиагностического уровня и сокращение длительности серопозитивности у животных после проведения профилактической вакцинации.

Это достигается тем, что при введении живых вакцин из штамма В.abortus 19 в дозе от 100 млн. до 80 тыс. микробных клеток, из штамма B.melitensis Rev-1 в дозе 1 млн. до 10 тыс. микробных клеток совместно с бруцеллезным антигеном в дозе 0,005-2,0 мг/мл снижается индукция специфических бруцеллезных антител у крупного и мелкого рогатого скота, что позволяет проводить диагностические исследования и выявлять инфицированных животных в более ранние сроки по сравнению с другими вакцинами, созданными на основе живых штаммов бруцелл.

Возможность осуществления изобретения с реализацией указанного назначения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 25 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена (антиген-ПА), полученного по А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №1256258, 1984 г.

Пример 2. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2,5 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,01 мг антигена-ПА.

Пример 3. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2,5 млн. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 4. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 20 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 5. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 6. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 7. Аналогичен примеру №5, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 8. Аналогичен примеру №5, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 9. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 10. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,005 мг на мл вакцины.

Пример 11. Аналогичен примеру №6, но антиген добавляем из расчета 0,2 мг на мл вакцины.

Пример 12. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 13. Аналогичен примеру №6, но антиген-ПА добавляем из расчета 2 мг на мл вакцины.

Пример 14. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 20 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 0,05 мг глюкопротеидного антигена (антиген-ГА), полученного по методике, описанной в А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №691056.

Пример 15. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 2 тыс. м.к. в мл. В 1 мл вакцины растворяем 1 мг антигена-ГА.

Пример 16. Коммерческую вакцину из штамма 19, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,5 мг белково-полисахаридного комплекса (антиген-БПК), полученного по А.С. СССР «Способ получения антигена» №467933.

Пример 17. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 18. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 50 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 19. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 5 тыс. м.к. в мл. В мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 20. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 1 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 21. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,05 мг антигена-ПА.

Пример 22. Аналогичен примеру №18, но антиген добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 23. Аналогичен примеру №18, но антиген-ПА добавляем из расчета 1 мг на мл вакцины.

Пример 24. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 2 мг на мл вакцины.

Пример 25. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,01 мг на мл вакцины.

Пример 26. Аналогичен примеру №19, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,2 мг на мл вакцины.

Пример 27. Аналогичен примеру №20, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,1 мг на мл вакцины.

Пример 28. Аналогичен примеру №21, но антиген-ПА добавляем из расчета 0,5 мг на мл вакцины.

Пример 29. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 50 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,1 мг антигена-ГА.

Пример 30. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 5 тыс. м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 0,2 мг антигена-БПК.

Пример 31. Коммерческую вакцину из штамма РЕВ-1, находящегося в S-форме, разводим физиологическим раствором с pH 7-7,2 до концентрации 500 м.к. в мл. В одном мл вакцины растворяем 2 мг антигена-БПК.

Пример 32. Морские свинки весом 300-350 грамм, самки, по принципу аналогов были разделены на группы. Опытных морских свинок иммунизировали вакциной, полученной из штамма 19 в примерах 4-13, вакциной из штамма РЕВ-1, полученной по примерам 15-26. Через 30 дней по 5 морских свинок из каждой группы убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов (всего 10 объектов) с целью определения расселяемости и приживаемости вакцинного штамма. Через 90 дней после иммунизации животных заражали вирулентным штаммом В.abortus 54 в дозе 10 ИД₁₀₀ и через 40 дней убивали и проводили бактериологическое исследование паренхиматозных органов и лимфатических узлов (всего 10 объектов) с целью определения уровня иммунитета у иммунизированных животных. В качестве контроля к каждой опытной группе служила группа животных, иммунизированных вакциной в той же концентрации микробных клеток, что и опытная, но без добавления антигена. В качестве контроля заражения использовали группу невакцинированных морских свинок и группу животных, вакцинированных одним антигеном. Через 15, 30, 60 и 90 дней после иммунизации у морских свинок брали кровь и проводили определение титра специфических антител в реакции агглютинации и реакции связывания комплемента с Антигеном бруцеллезным единым для РА, РСК, РДСК. Результаты бактериологических исследований представлены в таблицах 1 и 2, результаты серологических исследований представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 1 Результаты бактериологического исследование морских свинок, вакцинированных препаратами на основе вакцины из штамма 19 Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) Расселяемость вакцинного штамма, через 30 дней после иммунизации % иммунных животных Выделено культур вакцинного штамма Индекс расселяемости 1 2 3 4 5 Пример 4 0,5 мл (10 тыс. м.к. + 0,025 мг ПА) 68 90,7 100 Вакцина из штамма 19 10 тыс м.к. 31 41,3 20 Пример 5 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 0,025 ПА) 64 85,3 80 Вакцина из штамма 19 2 тыс. м.к. 27 36 0 Пример 6 0,5 мл (500 м.к. + 0,025 ПА) 40 53,3 80 Вакцина из штамма 19 500 м.к. 20 26,7 0 Пример 6 0,2 мл (200 м.к. + 0,01 ПА) 53 70,7 60 Вакцина из штамма 19 200 м.к. 11 14,7 0 Пример 6 0,1 мл (100 м.к. + 0,005 ПА) 37 49,3 60 Вакцина из штамма 19 100 м.к. 8 10,7 0 Пример 7 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) 60 80 80 Пример 8 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 1 мг МА) 69 92 100 Пример 9 0,5 мл (500 м.к. + 0,005 мг ПА) 28 73,3 80 Пример 10 0,2 мл (200 м.к. + 0,001 мг ПА) 42 56 60 Пример 11 0,1 мл (100 м.к. + 0,02 мг ПА) 43 57,3 60 Пример 12 0,2 мл (200 м.к. + 0,2 мг ПА) 56 74,7 80 Пример 13 0,5 мл (500 м.к. + 1,0 мг ПА) 47 62,7 80 Пример 14 0,5 мл (10 тыс. м.к. + 0,025 мг ГА) 51 68 100 Пример 15 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 1,0 мг ГА) 73 97,3 80 Пример 16 0,5 мл (500 м.к. + 0,25 мг БПК) 45 60 100

1 2 3 4 5 Антиген-ПА 0,05 мг - - 20 Антиген-ПА 0,5 мг - - 30 Антиген-ГА 0,1 мг - - 20 Вакцина из штамма 19 1 млрд. м.к. 67 89,3 100 Контроль заражения - - - 0

Таблица 2 Результаты бактериологического исследование морских свинок, вакцинированных препаратами на основе вакцины из штамма РЕВ-1 Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) Расселяемость вакцинного штамма, через 30 дней после иммунизации % иммунных животных Выделено культур вакцинного штамма Индекс расселяемости 1 2 3 4 5 Пример 18 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) 71 94,7 100 Вакцина из штамма РЕВ-1 10 тыс. м.к. 72 96 30 Пример 19 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,02 мг ПА) 75 100 100 Вакцина из штамма РЕВ-1 2 тыс. м.к. 75 100 30 Пример 19 0,2 мл (1 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) 72 96 90 Вакцина из штамма РЕВ-1 1 тыс. м.к. 69 92 0 Пример 19 0,1 мл (500 м.к. + 0,005 мг ПА) 74 98,7 70 Вакцина из штамма РЕВ-1 500 м.к 61 81,3 0 Пример 20 0,2 мл (200 м.к. + 0,01 мг ПА) 75 100 70 Вакцина из штамма РЕВ-1 200 м.к. 48 64 0 Пример 20 0,1 мл (100 м.к. + 0,005 мг ПА) 68 90,7 60 Вакцина из штамма РЕВ-1 100 м.к. 21 28 0 Пример 21 0,1 мл (50 м.к. + 0,005 мг ПА) 71 94,7 40 Вакцина из штамма РЕВ-1 50 м.к. 12 16 0 Пример 22 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,002 ПА) 75 100 100

1 2 3 4 5 Пример 23 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,2 мг ПА) 72 96 100 Пример 24 0,1 мл (500 м.к. + 0,2 мг ПА) 70 93,3 80 Пример 25 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,004 мг ПА) 71 94,7 50 Пример 26 0,2 мл (1 тыс. м.к. + 0,04 мг ПА) 74 98,7 60 Пример 27 0,2 мл (200 м.к. + 0,02 мг. ПА) 69 92 80 Пример 28 0,1 мл (50 м.к. + 0,05 мг ПА) 72 96 60 Пример 29 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,02 мг ГА) 73 97,3 100 Пример 30 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,08 мг БПК) 75 100 90 Пример 31 0,1 мл (50 м.к. + 0,2 мг БПК) 70 93,3 90 Антиген-ПА 2 мг - - 30 Антиген- ГА 1 мг - - 20 Антиген-БПК 0,5 мг - - 10 Антиген-БПК 0,05 мг - - 10 Вакцина из штамма Рев 1 100 млн. м.к. 74 98,7 100 Контроль заражения - - - 0

Таким образом, как видно из таблиц 1 и 2, введение в состав пониженных доз живой противобруцеллезной вакцины антигена в концентрациях от 0,01 до 2 мг/мл позволяет увеличить расселяемость вакцинного штамма в организме морской свинки по сравнению с вакцинным штаммом, введенным без антигена. Иммунизация морских свинок вакциной из штамма 19 в дозах от 100 до 10 тыс. микробных клеток и вакциной из штамма Рев-1 в дозах от 50 до 10 тыс. микробных клеток вызывает иммунитет максимально у 30% животных. Антигены, выделенные из бруцелл, в дозах от 0,05 до 2 мг также индуцируют аналогичный иммунитет. Совместное применение живой противобруцеллезной вакцины и антигена в аналогичных дозах вызывают иммунитет у 60-100% животных. Уменьшение или увеличение вводимых концентраций вакцины и антигена не приводит к достижению поставленной цели.

Таблица 3 Серологические реакции у морских свинок, привитых препаратом на основе штамма 19 Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) Реакция агглютинации Реакция связывания комплемента 15 дней 30 дней 60 дней 90 дней 15 дней 30 дней 60 дней 90 дней 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Пример 4 0,5 мл (10 тыс. м.к. + 0,025 мг ПА) 13,7±4,9 8,7±3,5 - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 10 тыс. м.к. 78,3±7,2 96,7±5,4 30 9 Отр. Пол. Пол. Пол. Пример 5 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 0,025 ПА) 17,4±1,8 - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 2 тыс. м.к. 65,3±4,8 30,7±6,3 7,2±4,1 5,4±3,7 Пол. Пол. Пол. Пол. Пример 6 0,5 мл (500 м.к. + 0,025 ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 500 м.к. 64,7±5,9 36,9±10,2 - - Отр. Пол. Пол. Пол. Пример 6 0,2 мл (200 м.к. + 0,01 ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 200 м.к. 26,9±6,3 32,3±4,7 7,7±5,6 - Отр. Пол. Пол. Пол. Пример 6 0,1 мл (100 м.к. + 0,005 ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 100 м.к. - 13,5±5,1 3,2±2,2 - Отр. Пол. Пол. Отр. Пример 7 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) 9,5±5,3 - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 8 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 1 мг ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Пример 9 0,5 мл (500 м.к. + 0,0 05 мг ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 10 0,2 мл (200 м.к. + 0,001 м г ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 11 0,1 мл (100 м.к. + 0,02 мг ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 12 0,2 мл (200 м.к. + 0,2 мг ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 13 0,5 мл (500 м.к. + 1,0 мг ПА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 14 0,5 мл (10 тыс. м.к. + 0,025 м г ГА) 18,6+4,0 - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 15 1,0 мл (2 тыс. м.к. + 1,0 мг ГА) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 16 0,5 мл (500 м.к. + 0,25 мг БПК) - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Антиген-ПА 0,05 мг - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Антиген-ПА 0,5 мг - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Антиген-ГА 0,1 мг - - - - Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из шт.19 1 млрд.м.к 453,9±47,7 326,4±51,3 233,8±41,9 70,2±21,4 Пол. Пол. Пол. Пол.

Таблица 4 Серологические реакции у морских свинок, привитых препаратом на основе штамма РЕВ-1 Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) Реакция агглютинации Реакция связывания комплемента 15 дней 30 дней 60 дней 90 дней 15 дней 30 дней 60 дней 90 дней 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Пример 18 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) 4,7±10,1 - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 10 тыс. м.к. 25,5±10,6 23,3±3,1 18,3±3,1 9,5±5,3 пол. пол. пол. пол. Пример 19 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,02 мг ПА) 7,6±3,9 - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 2 тыс. м.к. 20,0±3,6 22,2±3,6 4,6±13,5 - пол. пол. пол. пол. Пример 19 0,2 мл (1 тыс. м.к. + 0,01 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 1 тыс. м.к. - 15,0±1,9 17,4±1,8 - пол. пол. пол. пол. Пример 19 0,1 мл (500 м.к. + 0,005 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 500 м.к - - 13,1±4,5 17,6±4,2 пол. пол. пол. пол. Пример 20 0,2 мл (200 м.к. + 0,01 мг ПА) - - 0,6±0,4 - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 200 м.к. - 9,2±5,4 14,3±4,7 - пол. пол. пол. пол. Пример 20 0,1 мл (100 м.к. + 0,005 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 100 м.к. 4,2±2,6- 8,7±6,4 7,5±2,7 4,7±2,9 отр. пол. пол. отр. Пример 21 0,1 мл (50 м.к. + 0,005 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 50 м.к. 9,4±2,3 6,8±4,4 - - отр. пол. пол. отр. Пример 22 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,002 ПА) 12,5±1,6 - - - отр. отр. отр. отр. Пример 23 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,2 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Пример 24 0,1 мл (500 м.к. + 0,2 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Пример 25 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,004 мг ПА) 7,1±4,2 - - - отр. отр. отр. отр. Пример 26 0,2 мл (1 тыс. м.к. + 0,04 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Пример 27 0,2 мл (200 м.к. + 0,02 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Пример 28 0,1 мл (50 м.к. + 0,05 мг ПА) - - - - отр. отр. отр. отр. Пример 29 0,2 мл (10 тыс. м.к. + 0,02 мг ГА) 10,2±3,4 - - - отр. отр. отр. отр. Пример 30 0,4 мл (2 тыс. м.к. + 0,08 мг ВПК) - - - - отр. отр. отр. отр. Пример 31 0,1 мл (50 м.к. + 0,2 мг БПК) - - - - отр. отр. отр. отр. Антиген-ПА 2 мг - - - - отр. отр. отр. отр. Антиген-ГА 1 мг - - - - отр. отр. отр. отр. Антиген-БПК 0,5 мг 2,7±1,4 - - - отр. отр. отр. отр. Антиген-БПК 0,05 мг - - - - отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма Рев 1 100 млн. м.к. 166,0±31 204±30 186±18 71±8 пол. пол. пол. пол.

Как видно из таблиц 3 и 4, введение в состав антигена позволяет снизить уровень специфических бруцеллезных антител, регистрируемых коммерческими диагностикумами, без снижения уровня иммунитета.

Пример 33. Овец в возрасте 3-5 месяцев разбили на группы по 10 голов в каждой и привили противобруцеллезной вакциной из штамма 19, полученной по примерам 1-4. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 40 млрд. м.к., в малой 1,5 млрд. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма 19 в уменьшенных дозах, соответствующих использованным при приготовлении препарата в примерах 1-4. У животных на 7, 15, 30, 60, 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 5, 6, 7.

Таблица 5 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции с Бенгальским розовым (РБП-проба) Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РБП 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 1 2 мл (50 млн. м.к + 0,1 мг ПА) пол. Пол. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 50 млн. м.к. пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 2 2 мл (5 млн. м.к. + 0,02 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 5 млн. м.к. пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 3 2 мл (5 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Пример 4 2 мл (40 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 40 тыс. м.к. пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 40 млрд. м.к. пол. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма 19 1,5 млрд. м.к. пол. Отр. Отр. Отр. Отр.

Таблица 6 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции агглютинации Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РА 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день 1 2 3 4 5 6 7 Пример 1 2 мл (50 млн. м.к + 0,1 мг ПА) 67±23 34±8 - - - Вакцина из штамма 19 50 млн. м.к. 520±134 360±45 178±28 117±28 73±25 Пример 2 2 мл (5 млн. м.к. + 0,02 мг ПА) 51±11 42±23 25±13 - - Вакцина из штамма 19 5 млн. м.к. 400±91 250±51 158±28 118±14 83,3±27 Пример 3 2 мл (5 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) 47±19 31±17       Пример 4 2 мл (40 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) 34±12        

1 2 3 4 5 6 7 Вакцина из штамма 19 40 тыс. м.к. 125±21 167±25 120±20 78±20 48,3±17 Вакцина из штамма 19 40 млрд. м.к. 7245±241 5169±356 800±210 590±179 479±115 Вакцина из штамма 19 1,5 млрд. м.к. 1040±194 1234±420 471±130 301±124 112±65

Таблица 7 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции связывания комплемента Препарат, полученный по примеру № Доза препарата мл) РСК 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 1 2 мл (50 млн. м.к + 0,1 мг ПА) пол. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 50 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. Пример 2 2 мл (5 млн. м.к. + 0,02 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 5 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. Пример 3 2 мл (5 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Пример 4 2 мл (40 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 40 тыс. м.к. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма 19 40 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма 19 1,5 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол.

Пример 34. Овец в возрасте 3-5 месяцев разбили на группы по принципу аналогов и привили противобруцеллезной вакциной из штамма РЕВ-1, полученной по примерам 14-16. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 2 млрд. м.к., в малой 20 млн. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма РЕВ-1 в уменьшенных дозах, соответствующих использованным при приготовлении препарата в примерах 14-16. У животных на 7, 15, 30, 60, 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 8, 9, 10.

Таблица 8 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции с Бенгальским розовым (РБП-проба) Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РБП 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 17 2 мл (1 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 1 млн. м.к. пол. Пол. Пол. Пол. Пол. Пример 18 2 мл (100 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 100 тыс. м.к. пол. Пол. Пол. Пол. Пол. Пример 19 2 мл (10 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. Отр. Отр. Отр. Отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 10 тыс. м.к. пол. Пол. Пол. Пол. Пол. Вакцина из штамма РЕВ-1 2 млрд. м.к. пол. Пол. Пол. Пол. Пол. Вакцина из штамма РЕВ-1 20 млн. м.к. пол. Пол. Пол. Пол. Пол.

Таблица 9 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции агглютинации Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РА 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день 1 2 3 4 5 6 7 Пример 17 2 мл (1 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) - 18,7±13,5   - - Вакцина из штамма РЕВ-1 1 млн. м.к. 3,0±1,0 33,3±16,7 58,3±23,3 83,3±16,7 41,7±8,3 Пример 18 2 мл (100 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) - - - - - Вакцина из штамма РЕВ-1 100 тыс. м.к. - 10,0±5,1 21,0±8,8 60,0±10,6 43,8±6,2 Пример 19 2 мл (10 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 Вакцина из штамма РЕВ-1 10 тыс. м.к. - - 16,7±8,3 25,0±6,7 40,0±10,0 Вакцина из штамма РЕВ-1 2 млрд. м.к. 83,3±50,0 300,0±100,0 533,3±133,3 266,7±66,7 150,0±50,0 Вакцина из штамма РЕВ-1 20 млн. м.к. 100,0±50,0 114,5±21,0 216,0±58,0 107,5±15,0 100,0±9,3

Таблица 10 Результаты серологического исследования сыворотки крови овец в реакции связывания комплемента Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РСК 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 17 2 мл (1 млн. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. пол. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 1 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. Пример 18 2 мл (100 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 100 тыс. м.к. отр. пол. пол. пол. Пример 19 2 мл (10 тыс. м.к. + 0,1 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма РЕВ-1 10 тыс. м.к. отр. пол. пол. пол. Вакцина из штамма РЕВ-1 2 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма РЕВ-1 20 млн. м.к. пол. пол. пол. пол.

Пример 35. Телок в возрасте 4-6 месяцев разбили на группы по 20 голов в каждой и привили противобруцеллезной вакциной из штамма 19, полученной по примерам 1-4. В качестве контроля служили группы, привитые вакциной в полной дозе 80 млрд. м.к., в малой 3 млрд. м.к., а также животные, которым вводили культуру бруцелл из штамма 19 в уменьшенных дозах, соответствующих примерам 1-4. У животных на 7, 15, 30, 60 и 90 день брали кровь и исследовали в серологических реакциях (РБП, PA, PCK). Результаты представлены в таблицах 11, 12, 13.

Таблица 11 Результаты серологического исследования сыворотки крови телок в реакции с Бенгальским розовым (РБП-проба) Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РБП 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 1 4 мл (100 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 100 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. пол. Пример 2 4 мл (10 млн. м.к. + 0,04 мг ПА) отр. отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 10 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. пол. Пример 3 4 мл (10 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. отр. Пример 4 4 мл (80 тыс. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 80 тыс. м.к. пол. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма 19 80 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма 19 3 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол. пол.

Таблица 12 Результаты серологического исследования сыворотки крови телок в реакции агглютинации Препарат, полученный по примеру
№ Доза препарата (мл) РА 7 день 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 1 4 мл (100 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) - - 2,5±1,0 - - Вакцина из штамма 19 100 млн. м.к. 42,8±2,8 170,0±40,0 492,0±129,5 382,5±101,1 200,0±55,0 Пример 2 4 мл (10 млн. м.к. + 0,04 мг ПА) - - - - - Вакцина из штамма 19 10 млн. м.к. - 68,7±17,2 425,0±105,5 420,0±106,2 253,5±73,9 Пример 3 4 мл (10 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) - - - - - Пример 4 4 мл (80 тыс. м.к. + 0,2 мг ПА) - - - - - Вакцина из штамма 19 80 тыс. м.к. - 41,1±9,5 307,1±56,7 178,5±43,3 117,8±29,2 Вакцина из штамма 19 80 млрд. м.к. 215,3±204,8 1092,3±391,0 775,3±206,3 221,4±49,8 73,3±34,7 Вакцина из штамма 19 3 млрд. м.к. 307,1±56,7 552,9±142,4 178,5±43,3 411,0±9,5 30,0±8,6

Таблица 13 Результаты серологического исследования сыворотки крови телок в реакции связывания комплемента Препарат, полученный по примеру № Доза препарата (мл) РСК 15 день 30 день 60 день 90 день Пример 1 4 мл (100 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 100 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. Пример 2 4 мл (10 млн. м.к. + 0,04 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 10 млн. м.к. пол. пол. пол. пол. Пример 3 4 мл (10 млн. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Пример 4 4 мл (80 тыс. м.к. + 0,2 мг ПА) отр. отр. отр. отр. Вакцина из штамма 19 80 тыс. м.к. отр. отр. пол. пол. Вакцина из штамма 19 80 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол. Вакцина из штамма 19 3 млрд. м.к. пол. пол. пол. пол.

Таким образом, при введении живой вакцины В.abortus 19 в дозе от 100 млн. до 80 тыс. микробных клеток, живой вакцины из штамма B.melitensis Rev-1 в дозе 1 млн. до 10 тыс. микробных клеток совместно с бруцеллезным антигеном в дозе 0,005-2,0 мг/мл снижается индукция специфических бруцеллезных антител у крупного и мелкого рогатого скота, что позволяет проводить диагностические исследования и выявлять более полно инфицированных животных среди вакцинированных.

Представленные данные свидетельствуют о том, что введение антигена как одного из факторов агрессии в состав живой вакцины увеличивает остаточную вирулентность вакцинного штамма и, как следствие, уменьшает количество микробных клеток, необходимое для расселения в организме вакцинированного животного (табл. №1 и 2). В то же время параллельно с расселением и приживаемостью вакцинного штамма в организме развивается иммунный ответ на введенный антиген (который происходит быстрее, чем на живую вакцину, требующую для полноценного иммунного ответа время для расселения и приживаемости штамма), что, в свою очередь, ведет к сокращению длительности персистенции вакцинного штамма в организме и приводит к снижению серопозитивности у вакцинированных животных (табл. №3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13). Заявляемый диапазон доз антигена и вакцины при совместном их введении ведет к двоякому действию, что позволяет снизить концентрацию микробных клеток в одной профилактической дозе и одновременно уменьшить уровень специфических бруцеллезных антител у вакцинированных животных, вплоть до недиагностического, без снижения напряженности иммунитета (табл. №1, 2).

Предложенный способ апробирован с положительным результатом на лабораторных животных, 3500 овцах и на 800 головах крупного рогатого скота, работы проводили в период с 2000 по 2012 гг. на опытной базе ВИЭВа в Вышнем Волочке и в хозяйствах Туркменистана.

Данный способ снижения серопозитивности у живых противобруцеллезных вакцин может найти применение при проведении профилактической вакцинации сельскохозяйственных животных против бруцеллеза живыми вакцинами из штаммов В.abortus 19 и B.melitensis Rev-1.

Источники информации

1. Сборник научных трудов Сибирского отделения ВАСХНИЛ. - Новосибирск, 1984. - С.21-26.

2. Российский ветеринарный журнал. - М.: КолосС, 2006 г. - №4. - С.8-11.

3. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук «Бруцеллез животных в России: эпизоотологические особенности и совершенствование специфической профилактики», Искандаров М.И. Москва, 2012 г. С.382.

4. Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным», Новосибирск, 1989 г., с.145-146.

5. Книга «Патогенез и иммунология бруцеллеза». - М.: Медгиз, 1974 г., с.178-179.

6. А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №1256258, A61K 39/10, 1984 г.

7. А.С. СССР «Способ получения бруцеллезного антигена» №691056, A61K 39/10, 1974 г.

8. А.С. СССР «Способ получения антигена» №467933, A61K 39/10, 1977 г.

Представленное изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии, и касается способа снижения серопозитивности живых противобруцеллезных вакцин из штаммов Brucella abortus 19 или Brucella melitensis Rev-1 для сельскохозяйственных животных. Охарактеризованный способ включает введение животному вакцины из штамма В. abortus 19 в дозе от 100 млн. м.к. до 40 тыс. м.к. или вакцины из штамма В. melitensis Rev-1 в дозе от 1 млн. м.к. до 10 тыс. м.к. с одновременным введением бруцеллезного антигена в дозе от 0,02 до 0,1 мг. Изобретение позволяет сократить длительность серопозитивности у вакцинированных животных, вплоть до недиагностической, без снижения напряженности иммунитета и может быть использовано для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных диагностикумами при проведении оздоровления хозяйств от бруцеллезной инфекции. 13 табл., 35 пр.

Способ снижения серопозитивности живых противобруцеллезных вакцин из штаммов Brucella abortus 19 или Brucella melitensis Rev-1 для сельскохозяйственных животных, включающий введение животному вакцины из штамма В. abortus 19 в дозе от 100 млн. м.к. до 40 тыс. м.к. или вакцины из штамма В. melitensis Rev-1 в дозе от 1 млн. м.к. до 10 тыс. м.к. с одновременным введением бруцеллезного антигена в дозе от 0,02 до 0,1 мг.