ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ИЗ ШТАММА BRUCELLA ABORTUS 82 НА ОСНОВЕ АДЪЮВАНТА БИОГИДРОКСИАПАТИТА КАЛЬЦИЯ ДЛЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2024 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к вакцинам против бруцеллеза крупного рогатого скота.

Для профилактики бруцеллеза используют живые вакцины из штаммов, находящихся в стабильной S-форме - В.abortus 19, В. melitensis Rev-1, из RS-штаммов бруцелл (из штамма 82, 75/79-АВ), инактивированная вакцина из штамма В.abortus KB 17/100), а также вакцину на основе антигенов, выделенных из клеток бруцелл (бруцеллезная химическая вакцина) [Веселовский С.Ю. Изучение реактогенных и иммуногенных свойств вакцины против бруцеллеза из штамма Brucella abortus KB 17/100, с масляным адъювантом на крупном рогатом скоте и верблюдах // С.Ю. Веселовский, А.А. Частов, В.А. Агольцов / Научная жизнь, №1, 2016. - С. 129-137].

Недостатки. Данные вакцины при парентеральном введении в той или иной степени обладают серопозитивностью, т.е. способностью индуцировать специфические бруцеллезные антитела, которые длительно присутствуют в крови вакцинированных животных. В результате вакцинации в течение длительного времени затрудняется дифференциация вакцинированных животных от инфицированных.

Известен также способ профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота, заключающийся в иммунизации телок в 4-5-месячном возрасте в стандартной дозе 5,0 мл вакцины В.abortus шт. 82 с последующим серологическим исследованием животных через 10 месяцев и ревакцинацией серологически отрицательно реагирующих той же вакциной в той же дозе (Инструкция по применению вакцины против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма бруцелла абортус №82 живой сухой от 20.06.2014.)

Недостатком данного способа является продолжительность иммунитета после первичной вакцинации только в течение 10 месяцев, а также возможность спонтанного заражения животных в период до первичной иммунизации (до 4-5 месяцев). Вакцину живую В. abortus шт. 82 можно применять только в хозяйствах весной, когда коровы не являются стельными. В тех хозяйствах, где круглогодовой отел, эту вакцину применять нельзя, особенно в молочных хозяйствах, поскольку при применении ее во второй половине стельности, она может вызывать аборты.

Известен способ переработки костей для получения порошка биогенного гидроксиапатита кальция (биогидроксиапатита кальция) формулы (Са_10-у(PO₄)_6-х(СО₃)_х(ОН)_2+х-2у), где у - степень дефицитности Ca²⁺ а х - степень замещения СО₃^2-, с содержанием карбонат-группы до 4…5,5% масс., а также примеси ряда микроэлементов (натрия, магния, кремния и т.д.). Способ включает измельчение и обезжиривание костей, термическую обработку в печи до получения продукта белого цвета и измельчение полученного продукта, при этом измельчение перед обезжириванием осуществляют на фрагменты толщиной 3-8 мм, перед термической обработкой печь с газоотводом нагревают до температуры 700-1000°С и производят термическую обработку предварительно высушенных после обезжиривания костей при заданной температуре, а образовавшиеся пиролизные газы выводят через газоотвод в печи и конденсируют, обезжиривание осуществляют в кипящей воде, с добавлением карбонатной соли и органической кислоты [Патент РФ на изобретение №2642634. Способ переработки костей для получения гидроксиапатита / Пивоваров А.В., Муктаров А.Д. // Общество с ограниченной ответственностью «ВестИнТех», заявл. 03.29.2017, опубл. 25.01.2018; Реминерализирующий эффект нанокристаллов карбонат-гидроксиапатита на дентин / Р. Римондини, Б. Палаццо, М. Яфиско и др. / Проблемы стоматологии. Actual problems of stomatology, 2014. №4.; Баринов С.М., Биокерамика на основе фосфатов кальция / С.М. Баринов, B.C. Комлев / М.: Наука - 2005. - С. 50-60].

Известен способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis, заключающийся в многократной не менее 5 раз иммунизации кролика смесью диметилсульфоксид-антигена псевдотуберкулезного микроба и биогенного гидроксиапатита кальция с последующим взятием крови у иммунизированного животного и отделением из нее сыворотки, содержащей специфические иерсиниозные антитела, причем для одной иммунизации кролику массой 2-3 кг подкожно вдоль спины в 4-5 точек вводят 1,0 мл смеси раствора диметилсульфоксид - антигена Y. pseudotuberculosis и 1%-ной взвеси гидроксиапатита в соотношении 1:1, кроме того, доза диметилсульфоксид - антигена Y. pseudotuberculosis для одной иммунизации кролика составляет 2,0 мг, интервал между последующими иммунизациями - 2 недели [Патент РФ №2753265 С1. Действие гидроксиапатита на динамику синтеза псевдотуберкулезных антител / Иващенко С.В., Гонури Ч.К., Пивоваров А.В., Муктаров О.Д., Казаков В.Ю. (Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», 12.08.2021].

Недостатки: в данном способе адъювант использовался с сывороткой крови кролика, с вакциной же данный адъювант не использовался. Также в данном способе использовалась 1%-ная взвесь биогидроксиапатита кальция, при этом для вакцин биогидроксиапатит кальция ранее не использовался.

Прототипом изобретения можно считать вакцину, которая в качестве антигена содержит инактивированную с гидратом окиси алюминия бактериальную массу штамма В. abortus ВГНКИ N KB 17/100 с концентрацией 300-400x10⁹ бактерий в 1 см³, при следующем соотношении компонентов вакцины, об.%: инактивированная с гидратом окиси алюминия бактериальная масса штамма В.abortus N KB 17/100 с концентрацией 300х10⁹-400х10⁹ микробных клеток в 1 см³ 40-45,0; неполный адъювант Фрейда 50,0-55,0; физиологический раствор - остальное [Патент RU 2108110 C1, МПК А61К 39/10 C12N 1/20. Вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота / Калмыков В.В., Шумилов К.В. // Опубл. 1998-04-10].

Недостатком изобретения является высокая реактогенность вакцины, которая проявляется в виде формирования обширного инфильтрата в форме шара в месте введения препарата из-за масляного адъюванта. Испытания инактивированной вакцины из штамма В. abortus KB 17/100 показали, что после ее применения в месте введения появлялись большие разлитые отеки размером от крупного яблока до среднего арбуза. Отеки долгое время рассасывались, животные болели и худели, что делало невозможным ее применение в производственных масштабах. Поэтому рекомендовать такую вакцину в массовое производство затруднительно.

Технической задачей является разработка инактивированной вакцины против бруцеллеза из штамма Brucella abortus 82, с использованием адъюванта биогенного гидроксиапатита кальция, для крупного рогатого скота.

Техническая задача решается путем инактивации живой вакцины против бруцеллеза из штамма Brucella abortus 82 и разбавлением ее 2% дисперсией адъюванта биогидроксиапатита кальция с последующим введением ее крупному рогатому скоту в дозе 5,0 мл подкожно в область средней трети шеи при следующем содержании компонентов, мас. %:

биогидроксиапатит кальция - 2,

вакцина инактивированная из штамма Brucella abortus 82 - 100 млрд. м. к. в одной дозе 5,0 мл,

физиологический раствор хлорида натрия - остальное.

В таблице 1 представлены результаты общего анализа крови крыс после вакцинации с использованием инактивированной вакцины из штамма 82 на физиологическом растворе.

В таблице 2 представлены результаты общего анализа крови крыс после вакцинации с использованием инактивированной вакцины из штамма 82 на адъюванте биогидроксиапатите кальция.

В таблице 3 представлены исследования проб крови крыс с использованием метода реакции агглютинации спустя 14 дней после двукратного введения испытуемой вакцины.

В таблице 4 представлено наличие бруцелл во внутренних органах крыс после вакцинации испытуемой вакциной.

В таблице 5 представлено наличие бруцелл во внутренних органах морских свинок после вакцинации испытуемой вакциной.

В таблице 6 представлено испытание адъюванта биогидроксиапатита кальция на 5 головах для каждой концентрации.

В таблице 7 представлены результаты исследования проб крови телок и коров в неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве методом реакции связывания комплемента (РСК) спустя 14 суток после вакцинации различными вариантами вакцин.

В таблице 8 представлены результаты исследования проб крови телок и коров в неблагополучном по бруцеллезу хозяйстве методом Роз-Бенгал теста спустя 14 суток после вакцинации различными вариантами вакцин.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Приготовление вакцины инактивированной вакцины против бруцеллеза из штамма brucella abortus 82 на основе адъюванта биогидроксиапатита кальция

Инактивация живой вакцины против бруцеллеза из штамма Brucella abortus 82 проводилась в автоклаве на кафедре микробиологии, биотехнологии и химии Саратовского ГАУ. После этого приготовлен адъювант для усиления иммуногенности вакцины. В качестве адъюванта использовалась водная 1-10% дисперсия биогенного гидроксиапатита кальция по патенту №2642634. Для этого в стерильный флакон на 100,0 мл насыпали 1-10 г порошка биогидроксиапатита кальция дисперсностью 2-20 мкм, добавляли инактивированную вакцину из штамма Brucella abortus 82 - 100 млрд. м. к. в одной дозе 5,0 мл, затем добавляли физиологический раствор до 100 мл. Полученную смесь диспергировали при помощи ультразвука в течение 30 минут.

Пример 2. Доклинические испытания на лабораторных крысах

Крыс разделили на 2 группы по 5 голов в каждой группе. Первой группе вводили вакцину с испытуемым адъювантом в дозе 1,0 мл на крысу подкожно.

Второй группе крыс вводили вакцину без адъюванта, разведенную физиологическим раствором в дозе 1,0 мл на голову подкожно. Через день после введения и в последующие дни на месте введения вакцины никаких изменений не обнаружено. Также у животных отмечался аппетит и высокая двигательная активность.

При взятии крови использовали ингаляционную анестезию препаратом «Изофлуран» [Инструкция по ветеринарному применению лекарственного препарата Изофлуран (организация разработчик «Лабораторное Каризоо, С.А. »), Барселона, Испания].

Крыс брали из клетки с использованием специальных защитных перчаток. Затем крыс помещали в специально приготовленную пластиковую бутылку объем 0,5 литра с отрезанной частью дна и открытой крышкой. Затем дно крышки закрывали и удерживали одной рукой. Предварительно был приготовлен небольшой флакон, внутри которого была вата, смоченная 0,2 мл препарата «Изофлуран». В последующем этот флакон подносили к горлу бутылки с ватой для проведения ингаляционной анестезии, благодаря которому при вдыхании шло орошение дыхательных путей крысы.

Крыса, спустя 1 минуту, прекращала свою активную жизнедеятельность (вступала в состояние сна), после чего крысу вынимали из бутылки и помещали на специальный столик, лапы крысы фиксировали держателем, к носовым ходам крысы приставляли флакон с «Изофлураном» для поддержания ингаляционной анестезии состояния крысы на весь период операции.

В область груди крысы вводили иголку от 3-х миллилитрового шприца, нащупав область сердца и чувствуя пальцем толчкообразное сердцебиение.

После попадания иголки в сердце крысы вытягивали в шприц 2,0 мл крови, затем иглу вынимали. Далее кровь объемом 1,0-1,5 мл переносили в стерильную пробирку для постановки реакции агглютинации. Также параллельно наливали 0,5 мл крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом ЭДТА-К2 с сиреневой крышкой для общего анализа крови.

Через 2 часа после образования сыворотки крови ставили реакцию агглютинации. В стерильную пробирку наливали 2,4 мл физиологического раствора и добавляли к нему 0,1 мл сыворотки крови, полученной от крыс. В другие 4 пробирки наливали 0,5 мл физиологического раствора. Затем из первой пробирки с сывороткой крови брали 0,5 мл перемешанной жидкости и вносили в пробирку с 0,5 мл физиологического раствора (разведение 1:50), перемешивали и 0,5 мл перемешанной жидкости вносили в следующую пробирку (разведение 1:100). Потом из нее снова брали 0,5 мл жидкости и вносили в следующую пробирку (разведение 1:200), из этой пробирки также отбирали 0,5 мл исследуемой жидкости и вносили в следующую пробирку. Из последней пробирки отбирали 0,5 мл жидкости (разведение 1:400). Таким образом, было получено несколько разведений: 1:50, 1:100, 1:200, 1:400. Ко всем разведениям добавляли стандартный бруцеллезный антиген в количестве 2 капель (2 миллиарда микробных клеток в 1 мл) перемешивали встряхиванием и помещали в термостат при температуре 37°С на 4-6 часов. Потом оставляли на 14-16 часов при комнатной температуре и учитывали результат.

Результаты общего анализа крови крыс после вакцинации с использованием инактивированной вакцины из штамма 82 на физиологическом растворе и на адъюванте биогидроксиапатите кальция приведены в табл. 1 и 2., Количество лейкоцитов в крови крыс в вакцине на физиологическом растворе практически в 2 раза выше (13,56 х10⁹/л в среднем) по сравнению с кровью крыс, привитых вакциной на адъюванте (6,91х10⁹/л в среднем). Однако, в крови крыс, привитых вакциной на адъюванте, значительно больше содержалось лимфоцитов (56,0%) и моноцитов (7,8%) по сравнению с кровью крыс, привитых вакциной на физиологическом растворе (лимфоциты - 50,9% и моноциты - 1,2%), что свидетельствует о более напряженном иммунном ответе у первой группы крыс.

В дальнейшем проводили исследование сыворотки крови, полученной от вакцинированных крыс с использованием реакции агглютинации (Наставление по диагностике бруцеллеза животных от 29 сентября 2003 г. №13-5-02/0850), табл. 3.

Результаты реакции агглютинации в пробирках были следующие:

У 5 крыс, вакцинированных вакциной с физиологическим раствором, было полное просветление жидкости при наличии явно выраженного зонтика на дне пробирки в разведении 1:50 - реакция положительная (++++-). В остальных разведениях (1:100, 1:200, 1:400) никакой агглютинации не обнаружено - реакция отрицательная.

При этом в пробирках, полученных от 5 крыс, вакцинированных вакциной с адъювантом биогидроксиапатитом в разведениях 1:50 и 1:100 было отмечена слегка опалесцирующая жидкость и явно выраженный зонтик, при встряхивании который разбивался на хлопья или комочки - положительная реакция в обоих случаях (+++).

В остальных разведениях (1:200, 1:400) агглютинация на дне пробирки отсутствовала - отрицательная реакция.

Спустя 14 дней после повторной вакцинации заражали крыс живой вакциной против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма Brucella abortus 82 и через 1 месяц после заражения проводили эвтаназию подопытных животных.

С таких внутренних органов как селезенка, правый и левый поверхностный шейный лимфатический узел, печень, почки были сделаны посевы на жидкие и плотные питательные среды от крыс, привитых вакциной на физиологическом растворе и от крыс, привитых вакциной с использованием биогидроксиапатита кальция. Спустя 2-5 суток на всех питательных средах наблюдался рост микроорганизмов. Из каждой плотной питательной среды с посевов были сделаны мазки и окрашены по Граму.

Результаты свидетельствовали о том, что бруцеллы в виде мелких грамотрицательных микроорганизмов обнаружены в мазках, полученных от крыс, привитых вакциной на физиологическом растворе в правом и левом поверхностных шейных лимфатических узлах и селезенке. Защита от бруцеллеза составила 40%. Бруцеллы также были обнаружены в мазках, полученных из плотных питательных сред в правом поверхностном шейном лимфатическом узле и селезенке от крыс, привитых вакциной с использованием биогидроксиапатита кальция. Защита от бруцеллеза составила 60%, табл. 4.

Пример 3. Испытание на морских свинках

Двукратная вакцинация и заражение морских свинок проводилась аналогично крысам, табл. 5.

Анализ данных табл. 5 свидетельствует, что маленькие бруцеллы в виде мелких грамотрицательных микроорганизмов обнаружены в мазках, окрашенных по Граму, полученных от морских свинок, привитых вакциной на физиологическом растворе в правом поверхностном шейном лимфатическом узле. Защита от бруцеллеза составила 20%. Бруцеллы также были обнаружены в мазках, полученных из плотных питательных сред в правом и левом поверхностном шейном лимфатическом узле и печени от морских свинок, привитых вакциной с использованием биогидроксиапатита кальция. Защита от бруцеллеза составила 60%. Результаты серологических исследований проб крови морских свинок на бруцеллез схожи с результатами серологических исследований проб крови крыс.

Пример 4. Испытания инактивированной вакцины из штамма Brucella abortus 82 с 2% дисперсией биогенного гидроксиапатита кальция на крупном рогатом скоте

Инактивированная вакцина из штамма Brucella abortus 82 была испытана на крупном рогатом скоте в крестьянском хозяйстве. Вакцина вводилась в среднюю треть шеи подкожно с соблюдением правил асептики и антисептики. Место введения обрабатывалось 70%-ным раствором спирта. В эксперименте только 2% дисперсия биогенного гидроксиапатита кальция показала отсутствие реактогенности при достаточной иммуногенности (табл. 6). Вводили в дозе 5,0 мл (100 млрд. м. к.) инактивированной вакцины из штамма Brucella abortus 82 на одно животное, табл. 6.

В хозяйстве в текущем 2022 году была одна голова крупного рогатого скота, положительно реагирующая на бруцеллез. Далее вакцину вводили после двукратного отрицательного результата всего поголовья крупного рогатого скота в хозяйстве. Инактивированную вакцину вводили 10 головам маточного поголовья с адъювантом и 10 головам без адъюванта, остальное маточное поголовье в количестве 10 голов было вакцинировано живой вакциной из штамма Brucella abortus 82. Бычки хозяйства и телки в количестве 15 голов до 3 месяцев вакцинами против бруцеллеза не прививались. Все поголовье крупного рогатого скота хозяйства составляло 45 голов. Кровь для серологических исследований на бруцеллез бралась через 14 дней и через 3 месяца после вакцинации, табл. 7.

Из табл. 7 следует, что методом реакции связывания комплемента спустя 14 суток после вакцинации в пробах крови животных, привитых живой вакциной в 70% случаях отмечался положительный результат на бруцеллез, несколько меньше (60%) этот процент был отмечен у животных, привитых вакциной инактивированной из штамма 82 с адъювантом. Меньше всего положительно реагировавших животных методом РСК было выявлено у животных, привитых вакциной инактивированной из штамма 82 без адъюванта. Результаты исследования проб крови телок и коров в неблагополучном по бруцеллезу в хозяйстве методом Роз-Бенгал теста спустя 14 суток после вакцинации различными вариантами вакцин приведены в табл. 8.

Из табл. 8 следует, что методом Роз-Бенгал теста во всех 10 пробах крови животных, привитых вакциной, инактивированной из штамма 82 с адъювантом, получен положительный результат на бруцеллез. В 9 пробах крови животных из 10, привитых живой вакциной также были получены положительные результаты на бруцеллез. А у животных, привитых инактивированной вакциной без адъюванта, только у 5 голов при постановке реакции Роз-Бенгал теста были получены положительные результаты на бруцеллез. Спустя 3 месяца после вакцинации серологическими реакциями антител в крови всех испытуемых групп животных не было обнаружено (отрицательный результат на бруцеллез).

Полученные данные свидетельствуют о том, что вакцина, инактивированная из штамма 82 с адъювантом, в сравнении с живой вакциной из штамма 82 дает практически такой же профилактический эффект по образованию и пребыванию антител в крови крупного рогатого скота, что предусматривает возможность ее применения в молочных хозяйствах в любой период стельности коров. Рекомендуется применять вакцину через каждые 3 месяца после первой вакцинации для поддержания титра антител на высоком уровне до полной ликвидации бруцеллеза в хозяйстве.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к вакцинам против бруцеллеза крупного рогатого скота. Предложена инактивированная вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота, включающая на 100 мл: инактивированную бактериальную массу штамма Brucella abortus 82 с 100 млрд. м.к. в одной дозе 5,0 мл, биогидроксиапатит кальция - 2, физиологический раствор хлорида натрия - остальное. Изобретение позволяет расширить ассортимент вакцин против бруцеллеза крупного рогатого скота, после вакцинации антитела сохраняются в крови животных от 14 суток до 3 месяцев. 8 табл., 4 пр.

Инактивированная вакцина против бруцеллеза, включающая инактивированную бактериальную массу штамма Brucella abortus 82 и адъювант, отличающаяся тем, что используют штамм Brucella abortus 82 с 100 млрд. м.к. в одной дозе 5,0 мл, в качестве адъюванта используют биогидроксиапатит кальция при следующем содержании исходных компонентов, на 100 мл:

биогидроксиапатит кальция - 2,

инактивированная бактериальная масса штамма Brucella abortus 82 с 100 млрд. м.к. в одной дозе 5,0 мл,

физиологический раствор хлорида натрия - остальное.