СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/569 G01N33/50 

Изобретение относится к иммунологии, касается способа выявления микобактериальных антигенов и может быть использовано для индикации микобактерий туберкулеза в макроорганизме.

Известен способ выявления лепрозных антигенов в моче больных лепрой для оценки результатов лечения лепры методом радиоиммунного анализа /1/. Способ при достаточной чувствительности сложен в осуществлении, требует специального оборудования и реактивов.

Известен также способ выявления микобактериальных антигенов, включающий постановку реакции агглютинации латекса, сенсибилизированного микобактериальными антителами, с использованием в качестве второго компонента реакции сыворотки крови /2/ или посевов патологического материала /3/, а в качестве контрольного латексного препарата - латекса с блокированными глицином функциональными группами.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному объекту является способ выявления микобактериальных антигенов, включающий постановку реакции агглютинации латекса, сенсибилизированного кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза, с использованием в качестве второго компонента реакции - мокроты, а в качестве лиганда контрольного латексного препарата - иммуноглобулинов кролика, полученных до его иммунизации микобактериями туберкулеза /4/.

Известные способы выявления микобактериальных антигенов достаточно чувствительны и специфичны, а синтетический носитель позволяет получать стандартные серии диагностикума с высокой степенью воспроизводимости, однако они не обеспечивают обнаружение инфицированности у невакцинированных лиц с анергией к туберкулину вследствие иммунодефицитных состояний.

Цель изобретения - повышение эффективности.

Поставленная цель достигается использованием в качестве исследуемого материала мочи.

Способ осуществляется следующим образом.

Для постановки реакции агглютинации латекса, сенсибилизированного кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза, в качестве исследуемого материала используют мочу в разведении 1:(20-80) в фосфатном буферном растворе pH 8,6-8,9, причем постановку реакции проводят с надосадком, полученным отстаиванием мочи при температуре +4^oС в течение 24 ч. Реакцию считывают через 3-3,5 ч.

Предлагаемый способ соответствует критерию "новизна", поскольку характеризуется наличием отличительных от прототипа признаков. Он также соответствует критерию "изобретательский уровень", поскольку совокупность отличительных признаков, которая придает объекту изобретения свойства, обеспечивающие положительный эффект, в доступных источниках патентной и научно-технической информации не установлена.

Сущность способа поясняется примерами
Пример 1. Осуществление способа
Получение диагностического антительного препарата. К 5,0 мл 0,2%-ной водной суспензии латекса П3-Б2 добавляют 0,5 мг иммуноглобулина, выделенного из сыворотки крови кролика, иммунизированного М.tuberculosis. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, затем в течение 18 ч при температуре +4^oС и осторожном помешивании. Латекс отмывают фосфатным буферным раствором (pH 7,4-7,6), суспендируют в 1%-ном растворе глицина с повторным отмыванием фосфатным буферным раствором (pH 7,4-7,6). Сенсибилизированный латекс суспендируют в стабилизирующем растворе, разливают по ампулам и проводят лиофильное высушивание. Для проверки специфичности и чувствительности препарата готовят растворы антигенов различных видов бактерий. Антигены из M. tuberculosis, M. bovis, Staphylococcus aureus, Streptococcus iaecalis, Escherichia coli готовят путем ультразвукового разрушения бактериальных клеток. Концентрация бактериального белка в первой лунке планшеты для иммунологической реакции 100-110 мкг. Титрование до 1:320 проводят разведением белка в фосфатном буферном растворе (pH 8,6). В лунку планшеты с 50 мкл раствора антигена добавляют по 50 мкл разведенного в фосфатном буферном растворе лиофильно высушенного антительного латексного диагностикума. Титр 1:80 - 1:160, полученный с раствором антигенов M.tuberculosis и M.bovis, свидетельствует о достаточной чувствительности сухого антительного латексного диагностикума, а практическое отсутствие реакции агглютинации с антигенами стафилококков, стрептококков и кишечной палочки - о его специфичности.

Получение контрольного латексного препарата
Контрольный латексный препарат готовят как диагностический, но в качестве лиганда используют иммуноглобулины кролика, полученные до его иммунизации микобактериями туберкулеза.Отсутствие реакции агглютинации контрольного латексного препарата с антигенами M.tuberculosis, М.bоvis, St.aureus, St.iaecalis, E. coli подтверждает отсутствие антител к антигенам этих видов бактерий.

Подготовка мочи. Мочу собирают в пенициллиновые флаконы по 5 мл³ и ставят в холодильник, где выдерживают при температуре +4^oC в течение 24 ч, надосадок отсасывают пипеткой и используют для постановки реакции. Первичное разведение мочи - 1:20. Повторные исследования образцов проводят при их повторных разведениях 1:40 и 1:80. Разведения готовят с использованием фосфатного буферного раствора рН 8,6-8,9. Постановку реакции осуществляют в микроплашетах для иммунологических реакций, а учет реакции проводят через 3-3,5 ч.

Пример 2. Подтверждение специфичности
От 17 невакцинированных детей в возрасте до 1 года 1-й городской больницы г. Нижнего Новгорода брали мочу, которую подготавливали как в примере 1, надосадок использовали для постановки реакции в разведениях 1:20, 1:40 и 1: 80. Ни в одной пробе микобактериальных антигенов не выявляли.

Пример 3. Подтверждение эффективности
Исследования проводились в течение 1998-1999 г. в детском саду "Айболит" г. Нижнего Новгорода на 59 детях, вакцинированных BCG. У всех детей были хорошие прививочные рубчики. Мочу брали четырехкратно: за 2-3 дня до, а затем через 6-7, 40-45 и 85-90 дней после постановки реакции Манту. Микобактериальные антигены в моче определяли, как в примере 1. Результаты представлены в таблице.

Как видно из таблицы, при первом исследовании у 53 из 59 детей в моче обнаружены микобактериальные антигены в титрах 1:20 и 1:40, причем титр 1:40 был у 19 человек (30%). Через 6-7 дней после постановки реакции Манту у 46 детей (77,7%) установлены микобактериальные антигены в титрах 1:40-1:80, а через 40-45 дней после постановки реакции Манту количество микобактериальных антигенов в моче приближалось к исходному. У 2 детей микобактериальные антигены в моче не выявлялись ни до, ни после постановки реакции Манту, но при дальнейших исследованиях в моче были установлены микобактериальные антигены в титре 1: 20. Дети независимо от их реакции на туберкулин выделяли микобактериальные антигены с одинаковой частотой и в примерно равных титрах. Не было отмечено корреляции между величиной реакции Манту и количеством микобактериальных антигенов в моче. Из 59 обследованных детей 37 были в возрасте 5-7, а 22 - в возрасте 3-4 лет, причем у детей в возрасте 5-7 лет микобактериальные антигены в титре 1:(40-80) выделялись чаще (44 и 29% соответственно). По результатам исследований, проведенных на детях детского сада "Айболит", определяли чувствительность, специфичность и достоверность заявленного способа по методу Glickman and al. /5/. При обсчете результатов только одного исследования (до постановки реакции Манту) чувствительность составила 89, специфичность - 100 и достоверность положительных результатов - 100%. При обсчете результатов четырех исследований чувствительность способа была определена на уровне 96%. Результаты проведенного в детском саду "Айболит" обследования детей ставят под сомнение интерпретацию отрицательных результатов реакции Манту и теоретическое обоснование повторного вакцинирования BCG.

Таким образом, способ является более простым и удобным в связи с тем, что в качестве исследуемого материала используют мочу. Кроме того, для ее обработки не требуются специальные реактивы и оборудование. Способ позволяет за 3-3,5 ч идентифицировать наличие возбудителя в макроорганизме с использованием легкодоступного материала, при этом обеспечивается высокая до 96% точность.

Источники информации
1. Leprosy Rev., 1986, 57, 4, pp. 329-340.

2. Труды МХТИ, вып. 135. 1985. C. 88.

3. SU 1723526 А, 30.03.92.

4. RU 2147125 C1, 27.03.2000 - прототип.

5. Ann.J.Trop.Med.Hyg., 1978, v.27, 3, pp. 492-498.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для выявления микобактериальных антигенов. Сущностью изобретения является постановка реакции агглютинации с латексом, а в качестве исследуемого материала используют мочу в разведении 1:20 - 1:80 в фосфатном буферном растворе рН 8,6 - 8,9, причем постановку реакции проводят с надосадком, полученным отстаиванием мочи 24 ч при +4^oС. Техническим результатом является повышение эффективности выявления микобактериальных антигенов. 1 табл.

Способ выявления микобактериальных антигенов, включающий постановку реакции агглютинации исследуемого материала с латексом, сенсибилизированным кроличьими иммуноглобулинами к микобактериям туберкулеза, с использованием в качестве лиганда контрольного латексного препарата иммуноглобулинов кролика до иммунизации микобактериями туберкулеза, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют мочу в разведении 1:(20-80) в фосфатном буферном растворе (pH 8,6-8,9), причем постановку реакции проводят с надосадком, полученным отстаиванием мочи при температуре +4^oС в течение 24 ч.