ПЕПТИД И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07K5/65 A61K38/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммунорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Актуальность разработки новых безвредных иммунорегулирующих пептидов, способных остановить прогрессирующий рост таких заболеваний, как злокачественные новообразования, сепсис, хронические и вялотекущие инфекции, развивающиеся на фоне иммунодефицитных состояний, подтверждается большим количеством исследований, проведенных в этой области.

Наиболее распространенным способом выявления новых пептидов является выделение активных пептидных фракций из суммарных тканевых экстрактов, фракционирование и очистка вплоть до выделения индивидуального вещества и его идентификации (SU NN 1600047, 1638849 и 1737798). В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности, тимозин фракция 5 (Goldstein A.L., Guna A., Latz M.M., Hardy H. A. , Whihe A.), тималин (CH, N 6595 86). Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активным веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидных препаратов. В настоящее время осуществлен синтез ряда пептидов, обладающих иммунорегуляторными свойствами: PCT WO 089/06134, SU N 1541821, SU N 1518956, EP N 230052, EP N 406931, US N 5021551, US N 5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью, низкой токсичностью, отсутствием побочным эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине. В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы:
X-A-D-Trp-Y,
где
A-D-Glu, iD-Glu
X-H или Gly, Ala, Ile, Leu, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ- аминомаслянная кислота, ξ- аминокапроновая кислота;
Y-Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ- аминомаслянная кислота, ξ- аминокапроновая кислота, -OH или замещенный амид (C₁-C₃).

Целью изобретения было также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной формулы, что является определяющим при производстве фармацевтического препарата.

Сущность нового способа состоит в синтезе глутамилсодержащих пептидов в растворе путем раскрытия внутреннего ангидрида трет.-бутилоксикарбонил глутаминовой (D или L) кислоты соответствующим производным D-Trp-Y с последующим хроматографическим разделением α- и γ- изомеров. Дальнейший синтез проводили путем наращивания пептидной цепи с помощью активированнных эфиров третбутилоксикарбониламинокислот.

Пример.

H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
1. Получение Boc-D-Glu-OH
14,7 (0,1 моль) H-D-Glu-OH растворяли 200 мм дистилированной воды, одномолярным раствором KOH доводили pH до 10,2 и при интенсивном перемешивании добавляли раствор 33,0 г (0,3 моль) BOC₂O в диоксане. Следили за величиной pH на pH-стате. После окончания реакции смесь помещали в делительную воронку, экстрагировали из щелочной среды 3 х 150 мм этилацетатом, водную фазу медленно подкисляли 0,2% раствором серной кислоты до pH 3,0 и экстрагировали Boc-D-Glu-OH в органическую фазу (3 х 200 мм). Органический слой промывали 3 х 200 мм насыщенным раствором Na₂SO₄ до нейтральной среды, сушили над Na₂SO₄. Упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Выход: 16,7 г (68%).

Получение смеси Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH
16,7 г (0,068 моль) Boc-D-Glu-OH растворяли в 200 мл диметилформамида, охлаждали до 0^o и при перемешивании добавляли раствор 20,6 г (0,1 моль) N, N'-дициклогексилкарбодиимида в 100 мл диметилформамида. Смесь перемешивали 4 часа при 4^oC и осталяли 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, осадок промывали 2 х 50 мм диметилформамидом, фильтрат упаривали в вакууме до 1/2 объема и добавляли при охлаждении до 4^oC и интенсивном перемешивании 24,3 (0,1 моль) H-D-Trp-OK. Раствор оставляли постепенно нагреваться до комнатной температуры. Об окончании реакции судили по TCX в системе (хлороформ: этилацетат: метанол 6:3:1) до исчезновения пятна внутреннего ангидрида Boc-D-Glu кислоты. Остатки дициклогексилмочевины отфильтровывали, диметилформ-амид упаривали в вакууме. К маслообразному остатку добавляли 200 мм этилацетата и 200 мл 0,2% раствора серной кислоты. Органический слой отделяли, промывали до нейтральной среды насыщенным раствором Na₂SO₄ сушили над Na₂SO₄, этилацетатный раствор упаривали в вакууме. Полученный маслообразный осадок представлял собой смесь Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH. Общий выход масла составил 25,4 г (70%).

3. Получение H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
25,4 г (0,048 моль) смеси растворяли в 200 мл муравьиной кислоты, перемешивали при 40^oC в течение 1 ч и упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Разделение и очистку пептидов проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Сефадексом в градиенте 0,01-0,2 M пиридинацентатного буфера. Выход: 5,7 г (35%) H-D-Glu-D-Trp-OH и 5,7 г (35%) H-iD-Glu-D-Trp-OH.

В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики:
Первичная структура: H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
Брутто формула: C₁₆H₂₀N₃O₅
Молекулярный вес: 334,35
Внешний вид: Белый с желтоватым оттенком или серый порошок.

Растворитель: Легко растворим в воде, умеренно в спирте, практически нерастворим в хлороформе.

У. Ф. - спектр в области 250-300 нм имеет максимум 280 ± 2 мм, плечо 287 ± 2 нм.

Для ряда аналогов соединений пептида в табл. 1 приведены значения R_f1 в системе (хлороформ-метанол-32% уксусная кислота = 60:45:20) и R_f2 в системе (бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота = 5:5:4:1).

Биологическая активность нового пептида изучалась на мышах линии Balb/c. Клетки селезенки мышей суспендировали в среде RPMI 1640 с 2 мм глутамина и 5% инактивированной фатальной сыворотки и вносили в плоскодонные планшеты в количестве 100 мкл, соответственно, 200.000 клеток на лунку. Исследуемый препарат вносили в начале культивирования. В качестве митогена использовали конканавалин A в конечной концентрации 2 мкг на лунку. Планшеты инкубировали при 37^oC и 5% CO₂ в течение 48 ч. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3H-тимидина, вносимого за 24 ч до окончания культивирования в дозе 5 мкг/мл, с помощью сцинтилляционного с-счетчика и выражали в количестве распадов в минуту (CPM). Полученные результаты суммированы в табл.2.

Установлено, что новый пептид обладает способностью ингибировать пролиферацию селезеночных клеток.

С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ". - М., 1985. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000 кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть их ЛД50. Таким образом новый биологически активный пептид не является токсичным.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммуннорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине,ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии. В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы X-A-D-Trp-Y, где А - D-Glu, iD-Glu; X - H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомасляная кислота, ξ-аминокапроновая кислота; Y -Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ-аминомаслянная кислота, ξ - аминокапроновая кислота, - ОН или замещенный амид (С₁ - C₃), а также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной формулы. 2 табл.

1.Пептид формулы
Х - А - D - Тrр - Y,
где А - D-Glu, iD-Glu;
Х - Н или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота, -ОН или замещенный С₁-С₃-амид. 2. Способ получения пептида формулы
Х - А - D - Trp - Y,
где А - D-Glu, id-Glu;
Х - Н или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота, -ОН или замещенный С₁ - С₃-амид,
отличающийся тем, что синтез пептида проводят в растворе путем раскрытия внутреннего ангидрида третбутилоксикарбонил D- или LD-глутаминовой кислоты К-солью D-Trp-Y, затем наращивают пептидную цепь методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов с предварительным отщеплением третбутилоксикарбонильной группы путем обработки муравьиной кислотой и хроматографическим разделением α - и γ -изомеров.