СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХИХ СТЕРИЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК Российский патент 1998 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сухих стерильных питательных сред для культивирования разнообразных культур клеток, широко используемых в различных областях биологии, медицины, клеточной биотехнологии.

Известен способ получения питательных сред или их 10%-ных концентратов [1] . Растворяют исходные сухие смеси или отдельные компоненты и фильтруют растворы через стерилизующую мембрану ("холодная" стерилизация). К главным недостаткам этого способа относятся: краткие сроки годности (6 мес. - 1 год при 4 - 10^oC): дорогостоящее оборудование для мембранной стерилизации.

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом - является способ получения сухих питательных сред [2]. Соли (кроме хлористого кальция и магния) и глюкозу высушивают при 50 - 60^oC в течение 15 - 20 сут. Хлористый магний высушивают при температуре не выше 80^oC 20 -30 сут. Хлористый кальций сушат при 120^oC в вакуум-термостате при отрицательном давлении (-1 атм) в течение 3 - 4 сут. Этот режим обеспечивает получение сухих препаратов. Содержание кристаллизационной воды составляет для натрия двузамещенного фосфорнокислого - 2 молекулы, магния сернокислого - 5 молекул, все остальные соли - безводные.

Все ингредиенты перемешивают в шаровой мельнице в течение 3 ч.

Сухие питательные среды, расфасованные из расчета на 0,5 л жидкой среды, герметически упаковывают и стерилизуют на гамма-установках ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи "Исследователь и Стерилизатор" в разных дозах при мощности дозы 8500 рад/мин. Применяют оптимальную стерилизующую дозу для питательных сред - 3,5 Мрад.

Недостатками известного способа получения сухих питательных сред является то, что при облучении сухих порошков в стеклянных флаконах происходит потемнение стекла; питательные среды, содержащие индикатор феноловый красный, несколько изменяют цвет - становятся более темными, облученный порошок бикарбоната натрия становится голубоватым. Отмечено, что, чем больше остаточная влажность порошка, тем заметнее изменения в окраске в результате радиационной обработки. Возможно загрязнение примесями из окружающей среды при длительной сушке.

Задачей изобретения является создание наиболее часто используемых питательных сред Игла, 199М, RPM1-1640, MEM-3 в стандартной сухой стерильной форме, стабильной в течение продолжительного срока (5 лет), удобной для применения в практике культуральных работ в любых условиях, в том числе и полевых, обеспечивающей репродукцию клеточных культур с высокими индексами пролиферации, жизнеспособность и сохранение биологических свойств клеток в течение длительного пассирования.

Задача решается тем, что способ включает температурную сушку солевых компонентов, перемешивание всех ингредиентов и согласно изобретению адсорбционно-контактное досушивание сухой питательной среды в шаровой мельнице при помощи мешков с адсорбентом.

Сущность предлагаемого способа получения сухих питательных сред заключается в том, что:
а) входящие в состав питательных сред неорганические соли, содержащие гидратационную воду, предварительно высушивают до остаточной влажности, не превышающей 3%, при температурных режимах (см. таблицу), исключающих разложение солей и сокращающих продолжительность сушки с 45 до 2 сут;
б) высушенные таким образом неорганические соли (кроме натрия кислого углекислого) смешивают с остальными компонентами - аминокислотами (кроме L-глутамина для питательной среды 199М), витаминами, глюкозой и индикатором (феноловый красный) и подвергают помолу в шаровой мельнице при вращении барабана со скоростью 90 об/мин в течение 4 ч с последующим адсорбционно-контактным обезвоживанием смеси компонентов в течение 45-60 ч до остаточной влажности, не превышающей 1,5%, с помощью сорбента-поглотителя - гранулированного CaCl₂ - при интенсификации процесса сушки за счет вращения барабана со скоростью 40-50 об/мин;
в) сухую питательную среду фасуют, герметизируют и подвергают стерилизации на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в оптимальной дозе облучения 25 кГр.

Отличительными признаками предлагаемого способа получения сухих стерильных питательных сред от прототипа являются:
1. Режимы высушивания неорганических солей до остаточной влажности не более 3%, оптимизированные на основе их термогравиметрических характеристик (таблица).

2. Смешение и помол исходных компонентов для их измельчения и достижения однородности состава сухой питательной среды осуществляют в шаровой мельнице при скорости вращения барабана 90 об/мин в течение 4-5 ч.

3. Адсорбционно-контактное обезвоживание сухой питательной среды до остаточной влажности не выше 1,5% осуществляют в той же шаровой мельнице в течение 48-60 ч с помощью гранулированного сорбента - поглотителя влаги - при вращении барабана со средой со скоростью 40-50 об/мин в соотношении питательная среда : сорбент - 10 : 1.

4. Стерилизация расфасованной во флаконы сухой питательной среды на промышленном ускорителе электронов ИЛУ-6 в оптимальной дозе облучения 25 кГр.

Совокупность всех перечисленных признаков экспериментально разработана авторами, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о существенных отличиях предлагаемого метода от известных и соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Пример 1. Получение сухой стерильной питательной среды Игла.

В барабан шаровой мельницы загружают фарфоровые шары, затем последовательно высушенные (условия см. таблицу) неорганические соли, г:
Натрий хлористый - 1510,90
Калий хлористый - 88,80
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 35,77
Кальций хлористый-6-водный - 87,76
Магний хлористый-6-водный - 38,21
Д-глюкоза - 22,20
Осуществляют помол и смешивание компонентов в течение 2 ч при вращении мельницы с числом оборотов (90±5) об/мин. Затем в барабан шаровой мельницы последовательно загружают аминокислоты, г:
L-аргинин моногидрохлорид - 5,77
L-гистидин моногидрохлорид - 0,11
L-цистин - 2,66
L-тирозин - 3,99
L-изолейцин - 5,77
L-лейцин - 5,77
L-метионин - 1,77
L-фенилаланин - 3,55
L-треонин - 5,33
L-триптофан - 0,88
L-валин - 5,33
L-глутамин - 64,88
витамины, г:
Холин-хлорид - 0,22
Фолиевая кислота - 0,22
Амид никотиновой кислоты - 0,22
Пантотенат кальция - 0,22
Пиридоксаль моногидрохлорид - 0,22
Рибофлавин - 0,22
Тиамин моногидрохлорид - 0,22
Д-биотин - 0,22
Инозит - 0,08
Индикатор, феноловый красный - 4,44
Дальнейший помол осуществляют в течение 2 ч при скорости вращения барабана (90±5) об/мин. Полученную питательную среду с массовой долей влаги 3-5% сушат до массовой доли влаги 1,0-1,5% в том же барабане шаровой мельницы.

Из барабана шаровой мельницы удаляют мелющие шары и вносят в сухую питательную среду сорбент влаги - гранулированный, прокаленный при 220^oC в течение 24 ч и охлажденный до комнатной температуры в эксикаторе хлористый кальций, помещенный в мешочки из материала, проницаемого для молекул воды. Партию сухой среды (2 кг) выдерживают с сорбентом (200±10) г в течение 48-60 ч при вращении барабана со скоростью 40-50 об/мин.

Из барабана шаровой мельницы удаляют сорбент, питательную среду выгружают в сухую емкость и фасуют по о4,5 г во флаконы типа ФО-1-10. Флаконы укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими колпаками. Отдельно фасуют сухой компонент среды натрий углекислый кислый по 0,5 г в такие же флаконы.

Флаконы с питательной средой (440 шт.) и натрием углекислым кислым (440 шт.) стерилизуют при использовании промышленного ускорителя электронов ИЛУ-5 со следующими параметрами пучка электронов:
Энергия пучка - 2,15-2,20 МэВ
Ток пучка импульсный - 0,22±0,01 А
Частота следования импульсов - 6 Гц
Длительность импульсов - 500 мкс
Доза облучения - 25 кГр
Общие потери составляют 0,9%. В результате получается 440 флаконов питательной среды в комплексе с бикарбонатом натрия (440 флаконов), что рассчитано на приготовление 220 л питательной среды Игла жидкой стерильной.

Пример 2. Использование питательной среды Игла сухой стерильной для культивирования культур клеток.

Содержимое флакона с питательной средой переносят в бутылку со стерильной дистиллированной водой в асептических условиях. Бутылку плотно укупоривают стерильной резиновой пробкой и растворяют препарат в течение 15 мин при перемешивании.

Бикарбонат натрия переносят в бутылку с растворенной питательной средой в асептических условиях. Бутылку укупоривают стерильной резиновой пробкой и растворяют бикарбонат натрия в течение 15 мин при перемешивании.

Во флакон для культивирования вносят 100 мл питательной среды и 10 мл стерильной сыворотки КРС по ВФС 42-268ВС-90. Вносят посевную дозу клеток, например линии ДК-58 в количестве 80-100 тыс. кл/мл (50-60 тыс. кл/см² рабочей поверхности плоского флакона).

Культуру инкубируют 3-5 сут при температуре (37±1)^oC. Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,02%-ной массовой доли версена по ФС 42-65ВС-87 и раствор 0,25%-ный массовой доли трипсина по ФС 42-131ВС-88 в отношении 1: 1. Коэффициент пересева 1: 2. Клетки прикрепляются и образуют островки роста на первые сутки после посева и сливаются в монослой без признаков дегенерации на 4-е сут культивирования.

Состояние клеточного слоя оценивают путем микроскопирования при увеличении в 70-100 раз.

После 5-го пассажа проводят подсчет клеток. Из 5 мл суспензии, полученной после снятия клеток со стекла, берут по 0,5 мл и прибавляют изотонический раствор 0,9%-ной массовой доли натрия хлорида, содержащего 1% трипанового синего по МРТУ 6-09-3803-74. В камере Горяева по ТУ 64-1-816-77 подсчитывают количество жизнеспособных клеток. В результате общее количество клеток, полученное с одного флакона, увеличивается в 2 раза (индекс пролиферации питательной среды Игла равен 2).

Предлагаемая технология получения сухих питательных сред обеспечивает удешевление и упрощение способа, сокращает потери дорогостоящих компонентов, увеличивает производительность и безопасность стерилизации, позволяет получать большие количества стандартных питательных сред различных видов.

Список литературы
2. Новые методы культивирования животных тканей. - М.: Мир, 1976, с. 18-37.

2. Сперанская И.Д. Современные методы изготовления культуральных питательных сред. Автореф. дис. на соиск. уч. ст. к. б. н. - М., 1979, с.8, 85, 86.

Использование: биотехнология и касается способа получения сухих стерильных питательных сред для культивирования разнообразных культур клеток, широко используемых в различных областях биологии, медицины, клеточной биотехнологии. Сущность изобретения: способ заключается в том, что входящие в состав питательных сред неорганические соли высушивают до остаточной влажности, не превышающей З%, смешивают и подвергают помолу в шаровой мельнице, проводят последующее адбсорбционно-контактное досушивание во вращающемся барабане шаровой мельницы до остаточной влажности, не превышающей 1,5%. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения сухих стерильных питательных сред, включающий температурную сушку солевых компонентов, содержащих гидрационную воду, введение остальных ингредиентов в сухом виде и перемешивание их в шаровой мельнице, расфасовку, упаковку и последующую стерилизацию продукта радиационным излучением, отличающийся тем, что перед расфасовкой сухой питательной среды в шаровую мельницу загружают мешки с сорбентом и проводят адсорбционно-контактное досушивание продукта во вращающемся барабане шаровой мельницы. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что температурную сушку солевых компонентов осуществляют до остаточной влажности 3 мас.%. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перемешивание в шаровой мельнице ингредиентов среды осуществляют в течение 4 - 5 ч. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что адсорбционно-контактное досушивание проводят в соотношении питательная среда : адсорбент 10 : 1. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что частота вращения барабана шаровой мельницы в процессе досушки продукта составляет 40 - 50 мин_-1. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что адсорбционно-контактное досушивание сухой питательной среды проводят до остаточной влажности 1,0 - 1,5 мас.%. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что при стерилизации радиационным излучением в качестве источника излучения используют ускоренные электроны с дозой облучения 25 кГр.