СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОЙ СТЕРИЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА Российский патент 2001 года по МПК C12N5/00 C12N5/02 C12N13/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов, используемых для культивирования клеток млекопитающих.

Известен способ получения питательной среды для культур клеток животных на основе ферментативного гидролизата лактальбумина, включающий смешивание стерильных растворов Хэнкса, 5%-ного раствора гидролизата лактальбумина и бычьей сыворотки в соотношении 800:100:100 мл и последующую дополнительную фильтрацию [1].

Известен способ получения питательной среды для растительных клеток на основе ферментативного гидролизата казеина, включающий стерилизацию питательной среды автоклавированием при давлении 0,7-0,8 атм в течение 15 мин [2].

Известен способ получения питательной среды для культур клеток животных на основе ферментативного гидролизата белков мышц (ФГБМ), включающий растворение ФГБМ в солевом растворе Эрла или Хэнкса и последующую стерилизацию [3] .

Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом - является способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата казеина, включающий последовательное растворение нестерильных компонентов: неорганических солей, глюкозы, гидролизата, витаминов, фенолового красного и бикарбоната натрия в нестерильной очищенной воде, добавление к полученной нестерильной питательной среде 10%-ного раствора поливинилпирролидона, сыворотки КРС и антибиотиков и последующую стерилизующую фильтрацию через мембраны с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм с фасовкой во флаконы в асептических условиях [4].

К главным недостаткам этого способа относится то, что срок годности жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов составляет 6 месяцев при температуре 0-10^oC. Изготовление, транспортировка жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативных гидролизатов, а также ее хранение при температуре 0-10^oC требует значительных затрат и экономически невыгодно.

Задачей предлагаемого изобретения является предложение способа получения жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов непосредственно перед употреблением из сухих стерильных компонентов, что позволяет увеличить срок годности питательных сред до двух лет без потери ростовой активности.

Поставленная задача решается растворением смеси сухих гидролизатов, неорганических солей, глюкозы, фенолового красного, бикарбоната натрия в очищенной воде и последующей стерилизацией раствора, и согласно изобретению все компоненты питательных сред в сухом виде стерилизуют радиационным излучением с последующим их хранением, а смешивание и растворение указанных компонентов в стерильной очищенной воде осуществляют непосредственно перед употреблением. Все компоненты питательной среды перед стерилизацией разделяют на три части, в первую из которых входят гидролизаты, во вторую - смесь неорганических солей, глюкоза и феноловый красный, в третью - бикарбонат натрия, количественное содержание каждой части соответствует количественному составу среды, потом их высушивают до остаточной влажности не более 3%, стерилизуют облучением ускоренным электронами дозой 24-26 кГр.

Доза облучения подбирается таким образом, чтобы происходила полная стерилизация препарата без потери активности. Известно, что при использовании дозы облучения менее 20 кГр не всегда достигается полная стерилизация препарата [5]. На устойчивость сухих препаратов к ионизирующему облучению значительное влияние оказывает величина остаточной влажности, также известно, что препараты в сухом или замороженном состоянии более устойчивы к ионизирующему облучению, чем в растворе, и чем сильнее разбавлен раствор, тем большему разрушению подвергается растворенное вещество [5].

Разделение компонентов на три части обусловлено тем, что глюкоза и бикарбонат натрия являются реакционноспособными компонентами, и при облучении происходит их взаимодействие с другими компонентами, что приводит к потере свойств и снижению сроков хранения.

В 1 л жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативных гидролизатов содержатся следующие компоненты (табл.1).

Сущность изобретения. Соли, высушенные до остаточной влажности не более 3%, загружают в определенном порядке в барабанную мельницу и измельчают в течение 3 ч. Приготовленную смесь неорганических солей, глюкозу и феноловый красный, а также гидролизаты и бикарбонат натрия фасуют в емкости и стерилизуют ускоренными электронами, и непосредственно перед использованием растворяют сухие стерильные компоненты в стерильной очищенной воде.

Новыми по сравнению с прототипом являются следующие признаки способа:
- все компоненты питательной среды разделяют на три части, в первую из которой входят гидролизаты, во вторую - смесь неорганических солей, глюкоза, и феноловый красный, в третью - бикарбонат натрия, каждую часть фасуют в отдельные емкости, количественное содержание которых соответствует составу среды;
- все сухие компоненты стерильной питательной среды стерилизуются облучением ускоренными электронами дозой 24-26 кГр;
- сухие стерильные компоненты питательной среды растворяют непосредственно перед использованием в стерильной очищенной воде.

Предлагаемое нами техническое решение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение питательной среды сухой стерильной на основе ГСБМ.

Приготовление смеси неорганических солей, глюкозы и фенолового красного; фасовка смеси, гидролизата ГСВМ и натрия углекислого кислого в емкости.

980 г гидролизата ГСБМ, отвечающего требованиям ТУ 46 1220-80, фасуют в емкости по 2,00±0,06 г.

Для приготовления смеси используют неорганические соли квалификации "хч" или "осч" . Соли, содержащие гидратационную воду, предварительно высушивают (табл. 2). В барабанную мельницу загружают компоненты смеси в количестве, указанном в табл. 3, в следующей последовательности: натрий хлористый, калий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, кальций хлористый, глюкозa и феноловый красный и измельчают в течение 3 ч.

Измельченную смесь фасуют в емкости по 3,92±0,12 г, предварительно контролируют влажность, которая должна быть не более 3%.

Натрий углекислый фасуют в емкости по 0,15±0,04 г.

Исходя из загруженного количества получают 480 емкостей гидролизата ГСБМ, 480 емкостей смеси и 480 емкостей натрия углекислого кислого, которые стерилизуют ускоренными электронами дозой 24-26 кГр на установке ИЛУ-6 со следующими параметрами пучка электронов:
Энергия пучка 2,15-2,20 МэВ
Ток пучка импульсный 0,22 (0,001) A
Частота следования импульсов 6 Гц
Длительность импульсов 500 мкс
Доза облучения 24-26 кГр
Общие потери составляют 0,3%. В результате получается 478 емкостей гидролизата ГСБМ, 478 емкостей смеси и 478 емкостей натрия углекислого кислого, рассчитанного на приготовление 190 л жидкой питательной среды на основе ГСВМ.

Пример 2. Использование сухой стерильной питательной среды на основе гидролизата ГСБМ для культивирования клеток Нер-2.

Непосредственно перед использованием в асептических условиях в бутылку со стерильной очищенной водой переносят содержимое флакона смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу и феноловый красный, после растворения которого вносят содержимое емкости гидролизата, закрывают резиновой пробкой и растворяют в течение 5 мин при перемешивании. Натрий углекислый кислый вносят в раствор в последнюю очередь после растворения гидролизата. Натрий углекислый растворяют в течение 15 мин при перемешивании.

Предлагаемый способ позволяет в течение 20 мин приготовить из комплекта ПССГ 400 мл жидкой стерильной гидролизатной питательной среды.

Ростстимулирующую активность питательной среды, приготовленной на основе сухого стерильного гидролизата ГСБМ, смеси, содержащей неорганические соли, глюкозу и феноловый красный и натрия углекислого кислого, хранившихся при температуре 6±4^oC в течение двух лет оценивают на культуре перевиваемой линии клеток Нер-2.

В культуральный флакон вносят 100 мл питательной среды и 5% стерильной сыворотки крови КРС по ФС 42-268ВС-90, затем вносят посевную дозу клеток 100 тыс. кл/мл. Культуру инкубируют 3-4 суток при температуре 35 ± 1^oC . Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,02%-ной массовой доли версена и раствор 0,25%-ной массовой доли трипсина в соотношении 1:1. Коэффициент пересева должен быть 1:4.

Среду считают пригодной, если клетки прикрепляются к субстрату и образуют островки размножившихся клеток на первые сутки после посева и через 3-4 суток культивирования сливаются в монослой без признаков дегенерации. Подсчет клеток производят после 5-го пассажа; общее количество клеток при подсчете их в камере Горяева должно увеличиться не менее чем в 4 раза (Индекс пролиферации питательной среды на основе ГСБМ равен 4).

Таким образом, предложенный способ приготовления жидких стерильных питательных сред на основе ферментативных гидролизатов обеспечивает получение среды с высокими ростовыми свойствами на протяжении всего срока хранения в течение двух лет при температуре 6±4^oC.

Список литературы
1. Голубев Д.Б., Сомина А.А., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. - М.: Медицина, 1976 г., с. 25.

2. Автоpское cвидетельство СССР N 1331892 "Питательная среда для культивирования растительных клеток и протопластов", C 12 N 5/00, БИ 31, 1987.

3. Авторское свидетельство СССР N 1025722 "Питательная среда для выращивания культур клеток животных", C 12 N 1/00, БИ 24, 1983.

4. Авторское свидетельство СССР N 1735360 "Питательная среда для перевиваемых клеток млекопитающих", БИ 19, 1992.

5. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. - М.: Медицина, с. 133-153.

Изобретение относится к биотехнологии. Полученная питательная среда может быть использована для культивирования клеток млекопитающих. Готовят смесь, содержащую высушенные неорганические соли, глюкозу и феноловый красный. Фасуют в отдельные емкости сухой ферментативный гидролизат, полученную смесь и бикарбонат натрия. Стерилизуют компоненты среды ускоренными электронами. Растворяют стерильные компоненты непосредственно перед использованием в стерильной очищенной воде. Изобретение обеспечивает приготовление жидкой стерильной питательной среды с высокими ростовыми свойствами на протяжении всего срока хранения в течение двух лет при 6±4^oС. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата, используемой для культивирования клеток млекопитающих с проведением операции растворения компонентов питательной среды - сухого гидролизата, неорганических солей, глюкозы, фенолового красного, бикарбоната натрия в очищенной воде и стерилизации, отличающийся тем, что осуществляют стерилизацию компонентов питательной среды в сухом виде радиационным излучением с последующим их хранением, а их растворение осуществляют в стерильной и очищенной воде непосредственно перед употреблением. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что все компоненты питательной среды перед стерилизацией разделяют на три части, в первую из которых входит гидролизат, во вторую - смесь неорганических солей, глюкоза и феноловый красный, в третью - бикарбонат натрия, причем каждую часть фасуют в отдельную емкость, количественное содержание каждой части соответствует количественному составу среды. 3. Способ по .п.1 или 2, отличающийся тем, что стерилизацию компонентов питательной среды проводят облучением ускоренными электронами дозой 24 - 26 кГр. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что все используемые в питательной среде сухие компоненты имеют остаточную влажность не более 3%.