Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных иммунных препаратов (например, иммуноглобулинов), а именно к оценке специфической активности иммунных препаратов.
Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводится совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом.
Антитела - это особый вид белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые вырабатываются под влиянием антигенов и обладают способностью специфически связываться с ними. При этом антитела могут нейтрализовать токсины бактерий и вирусы (антитоксины и вируснейтрализующие антитела), осаждать растворимые антигены (преципитины), склеивать корпускулярные антигены (агглютинины), повышать фагоцитарную активность лейкоцитов (опсонины), связывать антигены, не вызывая каких-либо видимых реакций (блокирующие антитела), совместно с комплементом лизировать бактерии и другие клетки, например эритроциты (лизины).
На основании различий в молекулярной массе, химических свойствах и биологической функции выделяют пять основных классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Цельная молекула иммуноглобулина (или его мономера у IgA и IgM) состоит из трех фрагментов: двух Fab-фрагментов, каждый из которых включает вариабельный участок тяжелой цепи и связанную с ним легкую цепь (на концах Fab-фрагментов находятся гипервариабельные участки, формирующие активные центры связывания антигенов), и одного Fc-фрагмента, состоящего из двух константных участков тяжелых цепей.
Аналогом предлагаемого способа является система комплексного исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови, позволяющая тестировать параметры, изменение которых может свидетельствовать о нарушении толерантности к инфекции. Начальным этапом взаимодействия фагоцита с антигеном является движение фагоцитов, стимулом для которого служат хемоаттрактанты. Затем наступает этап адгезии, за который отвечают поверхностные рецепторы: селектины и интегрины (CD18, CD11a, CD11b, CD11с, CD62L, CD62E), которые определяются с помощью моноклональных антител (MAT) методом иммунофлюоресценции.
Определение следующей стадии поглощения должно входить в оценку фагоцитарного индекса. Для изучения поглощения используют дрожжи, латексные частицы, S.aureus, E.coli или Candida albicans. Подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, поглощенных нейтрофилами, осуществляется с помощью светового, люминисцентного микроскопа, проточного цитометра. Поглотительную способность оценивают по фагоцитарной активности и фагоцитарному индексу. Поглотительная способность нарушается при ряде острых и хронических инфекционных заболеваний, аутоиммунных процессах. Врожденные изменения этой стадии неизвестны. Стадия киллинга и расщепления осуществляется с помощью кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов. В первом случае происходит окисление кислорода НАДФ-H-оксидазной системой, в результате чего образуются активные формы кислорода, обладающие сильным микробоцидным действием, и их идентификация представляет важное звено функциональной активности фагоцитарных клеток.
Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа является метод определения активности естественных киллеров (NK), который проводят с помощью капиллярного теста, информативность которого возрастает при одновременном учете количества лимфоцитов с СD16-маркером. Принцип метода заключается в сокультивировании исследуемых клеток и клеток-мишеней в плоском капилляре с трипановым синим. После инкубации учитываются окрашенные клетки-мишени, что соответствует % спонтанной цитотоксичности. Показатель активности NK-клеток у доноров составляет 15%, хотя коэффициент вариации колеблется от 10% до 23% /1/.
Вышеизложенные аналоги и прототип предлагаемого изобретения не свидетельствуют о прямой антиинфекционной активности иммуноглобулинов, трудоемки, длительны (занимают от 24 до 72 часов); все эти тесты проводятся строго in vitro, и их условия далеки от условий макроорганизма.
Указанные методы не учитывают особенности биологии патогенных бактерий, которая свидетельствует о том, что способность вызывать инфекционные заболевания формировалась у патогенных микроорганизмов в направлении приобретения функций, позволяющих им проникать в организм хозяина, противостоять его защитным системам, а также вызывать нарушения деятельности физиологически важных систем. Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной стадии инфекционного процесса. К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные вещества (токсиканты), обуславливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной и возможную смерть хозяина 17.1.
Техническим результатом изобретения является повышение скорости оценки антиинфекционной активности иммунных препаратов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма.
Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом (например, иммуноглобулином), а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.
Способ осуществляется следующим образом.
Из пробирок Лейтона на покровное стекло с монослоем кожно-мышечных (ФКЭЧ) или легочных фибробластов (ФЛЭЧ) эмбриона человека, полученным по /3/, сливают ростовую среду и добавляют 1,8 мл иммунного препарата и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10 КОЕ/мл, получая конечную концентрацию тест-штамма 10 КОЕ/мл. Пробирки инкубируют 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке проводят совместное инкубирование 1,8 мл поддерживающей среды Игла с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в конечной дозе 108 КОЕ/мл. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА × ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.
Исследования по оценке антиинфекционной активности иммунных препаратов проводили на примере иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина.
Пример 1. Определение специфической антиинфекционной активности коммерческих препаратов иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина в отношении тест-штамма S.aureus 209 на культуре клеток (КК) ФКЭЧ. Среда для культивирования тест-культур микроорганизмов - мясо-пептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла.
В пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ помещали 1,8 мл иммуноглобулина нормального 20 мг/мл или пентаглобина 50 г/л и 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в дозе 109 КОЕ/мл для получения конечной концентрации тест-штамма 108 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали смесь 1,8 мл питательной среды Игла с 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирки инкубировали 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без иммуноглобулинов по показателю микробной нагрузки (таблица 1).
Как видно из данных таблицы 1, процент адгезии тест-штамма стафилококка золотистого достоверно снизился относительно контроля на 95,5% в присутствии иммуноглобулина нормального и на 97,5% в присутствии пентаглобина.
Предлагаемое изобретение позволяет также оценить антиинфекционную активность иммунных препаратов в присутствии бактериального фактора патогенности (токсиканта), например, белка А стафилококка.
Пример 2. Определение специфической антиинфекционной активности коммерческих препаратов иммуноглобулина человеческого нормального и пентаглобина в отношении тест-штамма S.aureus 209 на культуре клеток (КК) ФКЭЧ в присутствии токсиканта - белка А очищенного аффиннохроматографического сухого. Среда для культивирования тест-культур микроорганизмов - мясо-пептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла.
В пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ помещали 0,9 мл иммуноглобулина нормального 20 мг/мл или пентаглобина 50 г/л, 0,2 мл суточной тест-культуры S.aureus в дозе 109 КОЕ/мл для получения конечной концентрации тест-штамма 108 КОЕ/мл и 0,9 мл белка А в дозе 2 г/л. В качестве контроля использовали смесь 0,9 мл питательной среды Игла, 0,2 мл суточной тест-культуры микроорганизма в той же дозе и 0,9 мл белка А 2 г/л, помещенную в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирки инкубировали 2 часа при 37°С, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без иммуноглобулинов по показателю микробной нагрузки (таблица 2).
Как видно из данных таблицы 2, присутствие бактериального токсиканта - белка А стафилококка - полностью подавляло антиинфекционную активность иммуноглобулина нормального и не влияло на активность пентаглобина. Процент снижения адгезии тест-штамма микроорганизма в присутствии пентаглобина в данном случае составил 96,9%.
Данный пример подтверждает эффективность способа оценки различной антиинфекционной активности иммунных препаратов, уровень которой может зависеть от присутствия, кроме патогенной флоры, бактериальных токсикантов.
Литература
1. Иммунодиагностика и иммунокоррекция в клинической практике. - Под ред. И.Д.Столярова. - СПб: Сотис, 1999. - 176 с.
2. Ю.В.Езенчук. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. - М.: Наука, 1977. -215 с.
3. К.Б.Грабовская, А.А.Тотолян. Журн. Микробиол. - 1977. - №2. - с.32-36.
Адгезивная активность тест-штамма S.aureus в присутствии иммунных препаратов
контроль:
Адгезивная активность тест-штамма S.aureus в присутствии иммунных препаратов и токсиканта - белка А
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОВНЯ СОРБЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ СОРБЕНТА | 2004 |
|
RU2298036C2 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ | 2005 |
|
RU2296163C2 |
Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур | 2019 |
|
RU2723188C1 |
АНТИМИКРОБНОЕ СРЕДСТВО | 2007 |
|
RU2314821C1 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ КЛОСТРИДИЙ | 2006 |
|
RU2348037C2 |
Способ определения антиинфекционной активности биологически активного соединения | 1986 |
|
SU1359300A1 |
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ | 2015 |
|
RU2587636C1 |
ШТАММ БАКТЕРИЙ Lactobacillus casei/paracasei - ВГНКИ 10.02.62 ДЕП, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ | 2010 |
|
RU2465322C2 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ НА ЗАЩИТНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ | 2006 |
|
RU2318202C1 |
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ | 2012 |
|
RU2495565C1 |
Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных иммунных препаратов (например, иммуноглобулинов). Для этого в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим иммунным препаратом, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем. Изобретение обеспечивает повышение скорости оценки антиинфекционной активности иммунных препаратов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма. 2 табл.
Способ оценки специфической активности иммунных препаратов, отличающийся тем, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 ч тест-штамма микроорганизма с иммунным препаратом, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.
Иммунодиагностика и иммунокоррекция в клинической практике | |||
Под ред., И.Д.Столярова | |||
СПб.: Сотис, 1999, 176 с | |||
RU 2003131194 A, 10.04.2005 | |||
СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ПРОБИОТИКОВ РАЗЛИЧНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ И ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ПО УРОВНЮ ИХ АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ | 2003 |
|
RU2247570C2 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИКОВ | 2000 |
|
RU2187801C2 |
СПОСОБ КОНТРОЛЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИСБАКТЕРИОЗОВ | 1999 |
|
RU2177152C2 |
Авторы
Даты
2007-01-10—Публикация
2005-04-14—Подача