Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к получению иммунобиологических препаратов, предназначенных для профилактических и лечебных целей.
Известен способ получения тимозина на основе биохимического фракционирования полипептидов, входящих в состав тимуса теленка, и активных в отношении клеточного звена имунной системы. Этот способ осуществляется путем механического разрушения ткани тимуса теленка, последовательного воздействия на гомогенат солевыми растворами и органическими растворителями с последующей очисткой от нерастворимых и неактивных компонентов (см. статью Hooper J. A. et al. Purification and properties of bovine thymosin. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1975, v. 249, pp. 125-144).
Однако процедура выделения и оценки активности способа не позволяет выделить полипептиды, непосредственно усиливающие антибактериальную активность клеток, так как в состав фракций тимозина входят различные полипептиды, действующие преимущественно на Т-клеточное звено имунной системы, тогда как для усиления антибактериальной активности прежде всего необходима активация макрофагов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения полипептидов (Т-активина) путем гомогенизации ткани тимуса, ее аутолиза в растворе хлористого натрия, центрифугирования, нагревания, обработки надосадка ацетоном, ультрафильтрации растворенного осадка и его гель-хроматографии (см. SU Авт. свид. N 997298, кл. A 61 K 37/24, 1979).
Однако в составе препарата, полученного из природного сырья указанным способом, как правило, содержится несколько десятков различных полипептидов, характеризующихся самым широким спектром биологической активности, прежде всего направленной на Т-клеточное звено. Т-активин представляет собой сложную смесь пептидов различной молекулярной массы, p1 и биологической активности. В частности, установлено, что тимические факторы и в том числе некоторые компоненты Т-активина оказывают воздействие на функции макрофагов, в том числе на усиление их антибактериальной активности. Более того, показано, что функциональная гетерогенность действия Т-активина на макрофаги обусловлена его молекулярной гетерогенностью. Таким образом, действие компонентов Т-активина на антибактериальную активность макрофагов на фоне его влияния на Т-клеточное звено иммунной системы выражено относительно слабо.
Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание такого способа получения полипептидов тимуса для усиления антибактериальной резистентности, с помощью которого возможно производить удаление за счет различий молекулярной массы и заряда молекул неактивные полипептиды, а также компоненты, уменьшающие бактерицидность макрофагов.
Техническим эффектом, получаемым в результате реализации изобретения, является выделение полипептидов с более высокой биологической активностью компонентов, усиливающих антибактериальную резистентность за счет действия на макрофагальное звено имунной системы.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения полипептидов тимуса для усиления антибактериальной резистентности путем фракционирования тканей тимуса в солевых растворах и органических растворителях с дальнейшей ультрафильтрацией и гель-хроматографией выделение пептидных фракций, усиливающих антибактериальную резистентность, осуществляют гель-хроматографией высокого давления, в результате чего получают пептидные компоненты тимуса мол.м. 3500-15000 D и pi 3,5-5,1.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
Пример 1. Тимус телят, свежезамороженный при -20oC, в количестве 500 г очищают от соединительной ткани, гомогенизируют в 0,15 М NaCl (1:3). Полученный гомогенат подвергают аутолизу при 4 - 6oC в течение 12-16 ч, центрифугированию при 2000 g 30 мин. Супернатант фильтруют, нагревают до 80oC и выдерживают при этой температуре 15 мин. После охлаждения денатурированные белки удаляют центрифугированием при 2000 g 30 мин. Супернатант смешивают с охлажденным ацетоном (1: 7), осадок собирают центрифугированием при 2500 об/мин и проводят последовательное высаливание (NH4)2SO4 до 25%-ного насыщения при pH 7,0, затем до 50% насыщения при pH 4. Супернатант удаляют центрифугированием при 30000 g 40 мин. Осадок растворяют в 10 мМ Трис-HCl буфере pH 8,0, доводят концентрацию белка до 10 мг/мл и проводят ультрафильтрацию на фильтре Pellicon PSED (Millipore) с трехкратной промывкой буфером. Фильтрат после лиофилизации обессоливают гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-15 (2,5х25 см), затем подвергают гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 (2,5х90 см) в 10 мМ Трис-HCl-0,15 М NaCl буфере pH 8,0, отбирая фракцию, содержащую биологически активный материал и повторно обессоливая полученный препарат Т-активина. Лиофилизированный препарат растворяют в 0,01 М натрий-ацетатном буфере (pH 7,0) и подвергают гель-хроматографии высокого давления на колонке TSK G2000SW (7,5х600 мм), уравновешенной тем же буфером со скоростью элюции 0,6 мл/мин и собирают фракции полипептидов мол. м. 3500-15000 D и pi 3,5-5,1, оценивая молекулярную массу методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а изоэлектрическую точку - методом изоэлектрофокусирования в агарозном геле. Полученный материал подвергают рехроматографии на той же колонке и обессоливанию на той же колонке TSK G2000SW, уравновешенной дистиллированной водой и лиофилизируют.
Пример 2. Все этапы получения проводили, как в примере 1, за исключение того, что гель-хроматографию высокого давления на колонке TSK G2000SW проводили в 0,1 М Na-фосфатном буфере, содержащем 0,1 М KCl, при скорости элюции 0,6 мл/мин. В условиях высокой ионной силы не происходит разделения молекул на области, а материал выходит широким пиком.
Результаты экспериментальных исследований показали, что препарат, выделенный из тимуса предлагаемым способом, обладает выраженный биологической активностью, направленной на усиление антибактериальной резистентности за счет активации бактерицидности макрофагов перитонеального экссудата мышей (см. табл). Препарат полипептидов тимуса в минимальной дозе 1 мкг/мл усиливает антибактериальную активность к живым клеткам Salmonellae typhimurium. Эффект препарата не зависит от момента введения его мышам, тогда как Т-активин проявляет усиливающее антибактериальную резистентность действия только при внесении его за трое суток до заражения культурой сальмонелл. Полученный предложенным способом препарат имеет мол.м. 3500-15000 D и pi 3,5-5,1, содержит 5 главных компонентов. Прототип Т-активин содержит в своем составе около 20 основных компонентов мол.м. 15000-1000 D и pi 3,5-9,5.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить вещество с более высокой биологической активностью путем удаления неактивных компонентов и компонентов, угнетающих антибактериальную резистентность у мышей.
Изобретение позволяет выделить полипептиды с более высокой активностью компонентов, действующих на макрофагальное звено иммунной системы. Способ получения полипептидов тимуса осуществляют путем фракционирования тканей тимуса в солевых растворах и органических растворителях с дальнейшей ультрафильтрацией и гель-хроматографией, выделение пептидных фракций, усиливающих антибактериальную резистентность, проводят гель-хроматографию высокого давления, в результате чего получают пептидные компоненты тимуса мол. м. 3500-15000 D и рI 3,5-5,1. 1 табл.
Способ получения полипептидов тимуса для усиления антибактериальной резистентности путем фракционирования тканей тимуса в солевых растворах и органических растворителях с дальнейшей ультрафильтрацией и гель-хроматографией, отличающийся тем, что выделение пептидных фракций, усиливающих антибактериальную резистентность, осуществляют гель-хроматографией высокого давления, в результате чего получают пептидные компоненты тимуса с мол.м. 3500 - 15000 D и pI 3,5 - 5,1.
