СПОСОБ ФАГОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/70 C12Q1/14 C12Q1/08 C12Q1/04 C12Q1/70 C12R1/445 

Изобретение относится к методологии микробиологических исследований и может быть использовано в эпидемиологической практике при фаготипировании культур возбудителей брюшного типа, паратифа, стафилококков, стептококков.

Идентификация микробов фаготипирования основана на высокой специфичности кишечного действия фагов в пределах родов и семейств.

В частности, известно, что не все виды стафилококка, одного из наиболее часто встречающегося микроба, патогенны для человека, поэтому их фаготипирование особенно важно.

Известен способ фаготипирования при эпидемиологических обследованиях в случае пищевых токсикоинфекций (Справочник по микробиологическим и вирусологическим исследованиям./ Под ред. Биргера М.О. -М.: Медицина, 1973, с. 252 - 253).

На поверхность фага в чашке Петри, подсушенного в течение 30 - 40 мин в термостате, наливают 1 - 2 мл 4-часовой бульонной культуры, подлежащей типированию, равномерно распределяют на поверхности агара, дают жидкости испариться на столе или на 30 мин ставят в термостат. Дно чашки предварительно расчерчивают на 22 квадрата (по числу штаммовых фагов) и в каждый из квадратов наносят петлей N 2 по одному фагу с тест-разведением при простоянном порядке их распределения. Оставляют на 18 - 20 ч при 37^oC. Фаголизис прочитывают в падающем свете на темном фоне при помощи лупы. Принадлежность культуры к какой-либо группе устанавливают соответственно номерам фагов, вызвавших ее лизис.

Способ трудоемок и недостаточно точен, так как нанесение фага производится недозированно, в процессе лизирования зоны лизиса расширяются и может произойти их слияние.

Кроме того, возможны ошибки при нанесении фагов и при учете результатов процесса.

Наиболее близким к заявляемому способу по существу и назначению является методика фаготипирования культуры стафилококков с помощью 23 типовых фагов (Инструкция по применению бактериофагов стафилококковых типовых диагностических сухих - Англия (международный набор)).

По прототипу способ фаготипирования осуществляется следующим образом.

3 - 4-часовую бульонную культуру пастеровской пипеткой засевают газоном на свежеприготовленную чашку Петри с 1,2% агаром. Избыток культуры удаляют пипеткой. Чашку подсушивают 30 - 40 мин при 36 ± 1^oC.

Дно засеянной чашки расчерчивают на 23 квадрата (по числу бактериофагов) и в каждый квадрат засеянной среды петлей диаметром 2 мм или тонко оттянутой пастеровской пипеткой наносят каплю суспензии соответствующего бактериофага в рабочем разведении всегда в одном и том же порядке. После нанесения на газон культуры одного из бактериофагов петля прожигается, а пипетка меняется.

Наносить бактериофаг следует таким образом, чтобы не коснуться пипеткой поверхности газона и избежать тем самым переноса культуры. После подсыхания капель чашку переворачивают крышкой вниз и инкубируют.

Результаты фаголизиса учитывают по 4-крестовой системе.

Способ является очень трудоемким, результаты учета недостаточно надежны, так как при массовых эпидемиологических исследованиях неизбежны ошибки при нанесении фагов.

Кроме того, при большом количестве используемых фагов, например при 23 фагах для типирования стафилококка, зачастую происходит слияние зон лизиса, что приводит к неточности результатов.

Целью изобретения является повышение точности фаготипирования, снижение трудоемкости, обеспечение надежности учета результатов процесса фаготипирования при массовых эпидемиологических исследованиях.

Поставленная цель достигается тем, что типовые фаговые суспензии наносят на плотную питательную среду одномоментно и равномерно-дозированно капиллярными стержнями репликатора, заполняемыми суспензиями фагов из ячеек, расположенных в матрице конгруэнтно капиллярам репликатора, при этом соотношение суммы площадей торцовых сечений капилляров и поверхности плотной питательной среды обеспечивают равным 0,011 - 0,016 при равномерном расположении капилляров, затем наносят газон исследуемой культуры, инкубируют, учитывают и оценивают результаты фаголизиса бактерий, распределение фагов на поверхности среды и учет результатов фаголизиса бактерий проводят с использованием дешифраторной пластины с сигнатурой расположения стержней капилляров на репликаторе.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Нанесение фагов на поверхность питательной среды капиллярами, реализуемое с помощью известного дозатора-репликатора для посева бактериальных культур (авт.св. СССР N 1364633, C 12 M 3/00, опубл. 07.01.88, Бюл. N 1).

Конструкция репликатора, представляющая собой диск с равномерно расположенными на нем металлическими капиллярами со сквозными отверстиями, обеспечивает строго дозированное нанесение фагов на поверхность плотной среды, что повышает точность реакции фаголизиса бактерий.

Заполнение капилляров посредством матрицы с ячейками, расположенными конгруэнтно относительно капилляров обеспечивает постоянный порядок расположения фагов, который копируется на дешифраторной пластине, что упрощает и повышает точность и надежность учета результатов реакции фаголизиса бактерий.

Обеспечение заданного соотношения между суммарной площадью отверстий капиллярных каналов с равномерным распределением их на диске и площадью газона исследуемой культуры, установленного с учетом диагностических рабочих титров фагов (ДРГ), предотвращает слияние зон лизиса при большом количестве используемых фагов, что повышает точность результатов реакции.

Нанесение газона культуры после распределения фагов на поверхности плотной среды позволяет исключить обеззараживание стержней после каждого последовательного нанесения, что значительно сокращает трудоемкость процесса.

Использование дешифраторной пластины с сигнатурой расположения стержней капилляров на репликаторе при распределении фагов на поверхности плотной среды и учете результатов фаголизиса бактерий обеспечивает постоянство порядка расположения типовых фагов, исключает возможность ошибок при массовых эпидемиологических исследованиях, что повышает надежность результатов обследований.

Соотношение между суммарными площадями капилляров и газона исследуемой культуры, равное 0,011 - 0,016, является оптимально выбранным, так как снижение этой величины ниже 0,011, то есть увеличение площади газона, нецелесообразно, а увеличение выше 0,016, то есть уменьшение площади газона, может привести к слиянию зон лизиса.

Возможность применимости изобретения подтверждается примером конкретного выполнения заявляемого способа.

Пример 1. Готовят рабочие разведения суспензии 23 стафилококковых бактериофагов (международный набор АНГД, Англия) и вносят их в ячейки матрицы, конгруэнтно расположенные капиллярам репликатора. Ячейки располагают в порядке соответствия сигнатуры дешифраторной пластины.

Репликатор стерилизуют обжиганием в спирте и погружают стержни с капиллярными каналами (диаметр каждого 2 мм) в ячейки с суспензиями бактериофагов, фиксируя конгруэнтность выступом репликатора и выемкой матрицы. Затем стержни репликатора извлекают из матрицы и торцевыми отверстиями стержней последовательно касаются плотной питательной среды в шести чашках Петри диаметром 63 см, с одновременной отметкой стеклографом, сориентированной выступу репликатора, экспозируют нанесение суспензии при комнатной температуре в течение 10 мин до полного высыхания капель бактериофага. Затем на чашки наносят по 1 мл подготовленных суспензий исследуемых культур стафилококков с плотностью 2 • 10⁸ микробных клеток/мл. Избыток суспензии удаляют пипеткой. Каждую чашку помечают в соответствии с исследуемой культурой. Затем чашки подсушивают в течение 30 мин при 37^oC до полного впитывания агаром жидкости, ставят их крышкой вниз и инкубируют в течение 20 ч при 30^oC. Дешифраторную пластину с нанесенной конгруэнтно репликатору сигнатурой поочередно подкладывают под днище каждой из 6 чашек и учитывают зоны фаголизиса на каждой чашке с их оценками по 4-крестовой системе.

Дешифраторные пластины могут быть подготовлены с сигнатурой на разные варианты использования в зависимости от количества типовых фагов.

При использовании заявляемого способа объем суспензий наносимых фагов и плотность бактериальной культуры соответствуют рекомендациям инструкции, структура зон лизиса не нарушалась даже при максимальном количестве фагов.

Время, затраченное на осуществление фаготипирования стафилококковых культур (за исключением периода инкубации и подсушивания), составило 45 мин, а по способу прототипа - 4,5 ч.

Фиксирование порядка нанесения фагов исключает вероятность ошибочных манипуляций при нанесении фагов петлей.

В 1996 г. по предлагаемому способу было фаготипировано 295 выделенных культур золотистого стафилококка, среди которых типируемые штаммы составили 31%. При этом за счет сокращения времени на манипуляции при фаготипировании было высвобождено около 20 рабочих дней.

Использование предлагаемого способа позволит повысить качество и производительность не только массовых бактериологических исследований, но и аналогичных трудоемких манипуляций в микробиологической практике.

Изобретение предназначено для идентификации бактерий при эпидемических исследованиях. Типовые фаговые суспензии наносят на плотную питательную среду. Нанесение осуществляют одномоментно и равномерно-дозированно репликатором. Репликатор представляет собой диск с равномерно расположенными на нем металлическими капиллярами со сквозными отверстиями. При этом соотношение суммы площадей торцевых сечений капилляров и поверхности плотной среды составляет 0,011 - 0,016. Затем наносят газон исследуемой культуры и инкубируют. Дешифраторную пластину с нанесенной конгруэнтно репликатору сигнатурой поочередно подкладывают под днище каждой из чашек. Учитывают зоны фаголизиса на каждой чашке с их оценками по четырехкрестовой системе. Конструкция репликатора обеспечивает строго дозированное нанесение фагов на поверхность плотной среды, что повышает точность реакции фаголизиса бактерий. Заполнение капилляров посредством матрицы с ячейками, расположенными конгруэнтно относительно капилляров, обеспечивает постоянный порядок расположения фагов, который копируется на дешифраторной пластине, что упрощает и повышает точность и надежность учета результатов реакции фаголизиса бактерий. Заданное соотношение площадей сечений капилляров и поверхности среды, установленное с учетом диагностических рабочих титров фагов, предотвращает слияние зон лизиса при большом количестве используемых фагов, что повышает точность результатов реакции.

Способ фаготипирования бактериальных культур, включающий равномерно-дозированное распределение типовых фаговых суспензий на поверхности газона исследуемой культуры с последующим инкубированием, учетом и оценкой фаголизиса бактерий, отличающийся тем, что фаговые суспензии наносят на плотную среду одномоментно капиллярными стержнями репликатора, заполняемыми суспензиями фагов из ячеек, расположенных в матрице конгруэнтно капиллярам репликатора, при этом соотношение суммы площадей торцевых сечений капилляров и поверхности плотной среды обеспечивают равным 0,011 - 0,016 при равномерном расположении капилляров, затем наносят газон исследуемой культуры, а распределение фагов по поверхности плотной питательной среды и учет результатов фаголизиса бактерий выполняют с использованием дешифраторной пластины с сигнатурой расположения капилляров на репликаторе.