ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO METSCHNIKOVII, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАГА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12N7/00 C12R1/63 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике Vibrio metschnikovii.

Вибрион Мечникова относится к патогенным микроорганизмам рода Vibrio. Он является возбудителем гастроэнтеритов и по общности локализации в кишечнике и идентичности токсического воздействия на организм человека обладает сходством с холерными вибрионами.

При идентификации холерных вибрионов используются специфические диагностические бактериофаги. Диагностический фаг для идентификации Vibrio metschnikovii не разработан.

Известен штамм бактерий Vibrio cholerae 042 серовара, применяемый в качестве индикаторной культуры для выявления умеренного фага 042/1 серовара и его вирулентных мутантов (см. СССР А.С. №1391090, кл. C12N 1/20, 16.04.1986 г.).

Однако использовать его для обнаружения бактериофагов V. metschnikovii не представляется возможным, так как штамм энтеропатогенного вибриона 042 серовара лизируется только специфическим фагом 042/1.

За прототип выбран способ диагностики признаков штаммов Vibrio metschnikovii (см. статья Савельев и др. «Характеристика штаммов Vibrio metschnikovii, выделенных в Ставропольском крае», сборник материалов проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы», г.Ростов-на-Дону, вып. №19, 2006 г., стр.39-44), заключающийся в проведении реакций и тест-систем на семи штаммах Vibrio metschnikovii, которые отражают вариабельность многих из видовых признаков вибриона.

Однако использование известного способа не позволяет выделить специфические свойства возбудителя, которые получают, используя фаговые препараты. Отсутствие фагочувствительного штамма-хозяина является препятствием для выделения фага.

Кроме того, для полного изучения штаммов и их идентификации (кроме указанных в статье) требуются дополнительные реактивы и дорогостоящие препараты, как, например, применение молекулярного зонда с нуклеотидными последовательностями, гомологичными ДНК V. metschnikovii, которыми диагностические лаборатории часто не располагают.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является изыскание штамма, способного выявлять специфический фаг Vibrio metschnikovii и обеспечивать в качестве штамма-ментора его размножение.

Указанный технический результат достигается получением штамма бактерий Vibrio metschnikovii KM-185 Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», используемый в качестве индикаторной культуры для выявления специфического фага ФК-85, находящегося в коллекции бактериофагов РостНИПЧИ.

Штамм бактерий Vibrio metschnikovii KM-185 (Р-14015) выделен из воды при исследовании на вибриофлору реки Дунай в районе г.Комарно в 1989 г.

Способ выделения бактерий V. metschnikovii

Исследуемый материал (испражнения, моча, вода и др.) засевают в количестве 0,5-1,0 мл в 50-100 мл 1%-ной пептонной воды (рН 8,0) (I пептон) и петлей на щелочной агар (рН 7,6-7,8).

Через 6 часов от начала исследования с поверхности I пептона петлей производят высев на пластинку щелочного агара и в 5-8 мл 1%-ной пептонной воды (II пептон). Посевная доза при пересеве в пептонную воду должна быть не менее 2-3 обычных бактериологических или одной большой петли диаметром 5 мм.

Через 6 часов (12 часов от начала исследования) производят высев петлей с поверхности II пептона на щелочной агар.

Через 18-20 часов инкубирования посевов при 37°С отбирают выросшие изолированные колонии со щелочного агара и проводят идентификацию.

Штамм Vibrio metschnikovii депонирован под №КМ-185 (Р-14015) в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М»).

Культурально-морфологические признаки

В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Грамму, клетки имеют вид грамотрицательных слегка изогнутых палочек. Подвижные (при выращивании в 0,3% щелочном агаре с 1,5% NaCl наблюдается помутнение столбика агара), при просмотре в электронном микроскопе-монотрихи. Спор и капсул не образуют.

На твердых питательных средах (на 1,5% агаре Мартена с 1,5% NaCl (рН 7,6±0,2)) вибрионы образуют колонии круглой формы, более плотные в центре с голубоватым оттенком от 1 до 5 мм в диаметре, с ровным краем при выращивании при 37°С в течение 18-24 часов.

На жидких питательных средах (бульон Мартена с 1,5% NaCl (рН 7,6±0,2)) дает равномерную муть и нежную пленку на поверхности.

Физиолого-биохимические свойства

Тест на оксидазу отрицательный, разлагает глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, маннозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты без газа, не ферментирует арабинозу, лактозу, орнитиндекарбоксилазу, салицин, образует ацетилметилкарбинол, не растет при концентрации 7-10% хлорида натрия, в 1% пептонной воде.

Оптимальные показатели температуры и рН среды для культивирования Vibrio metschnikovii - 35-37°С, рН 7,6-8,0, помогут расти при температуре от 10 до 40°С и pH 9,0-9,2.

Серологические свойства

Не агглютинируется холерными диагностическими сыворотками О, RO, Инаба, Огава, моноварными вибрионными сыворотками других (02-083) О-сероваров.

Штамм КМ-185 способен выявлять и обеспечивать репродукцию фагов 15818 и 17521, выделенных из одноименных штаммов V. metschnikovii - (таблица 1).

Фаг 15818 формирует на газоне штамма КМ-185 негативные колонии типичной морфологии, круглой формы, 3±1 мм в диаметре, с плотным центром, узкой зоной неполного лизиса по периферии, а также с прозрачным центром.

По электронно-микроскопической структуре фаги относятся к IV морфологической группе А.С.Тихоненко, т.е. имеют многогранную головку и длинный несокращающийся отросток.

Фаг ФК-85 специфически лизирует 3 штамма V. metschnikovii (таблица 2), что может быть использовано при лабораторной диагностике. Фаг, продуцируемый V. metschnikovii - 15818, депонирован в Центре депонирования бактериофагов РостНИПЧИ под номером ФК-85. Полученная к фагу ФК-85 антифаговая сыворотка нейтрализовала в 100% фаги ФК-85 (15818) и 17521, что свидетельствовало о серологическом родстве фагов. Размножается штамм КМ-185 в бульоне, на агаре Мартена с 1,5% NaCl (pH 7,6±0,2)), хранят его в лиофилизированном состоянии.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

ПРИМЕР. Индикаторные свойства штамма КМ-185 в отношении умеренного фага ФК-85 и его вирулентного мутанта выявляют в следующем опыте методом Грациа и капли.

Фильтрат 3-суточной бульонной культуры штамма, исследуемого на лизогению, в количестве 1,0 мл смешивают с 0,2 мл бульонной четырехчасового роста культурой КМ-185 и 5,0 мл 0,7% агара Мартена с 1,5 NaCl (предварительно расплавленного и охлажденного до 45°С) и выливают на пластинки 2%-ного агара Мартена с 1,5% NaCl в чашке Петри. После застывания нанесенного слоя чашку перевертывают и культивируют при 37°С 18-20 ч (метод Грациа).

Бульонную культуру четырехчасового роста штамма КМ-185 вносят в количестве 0,5 мл в 5,0 мл 0,7% агара Мартена с 1,5%) NaCl, тщательно перемешивают и выливают на поверхность пластинки 2%-ного агара Мартена в чашке Петри. На застывшую поверхность наносят каплю исследуемого фильтрата. При наличии небольшого количества корпускул фага в фильтрате он обнаруживается методом Грациа в виде изолированных негативных колоний на газоне штамма КМ-185. При высокой концентрации фага в фильтрате его обнаруживают методом капли в виде сливного литического пятна на газоне штамма КМ-185 на месте нанесения фильтрата.

Полученный фаг размножают в жидкой среде на штамме КМ-185. К 50,0 мл бульона Мартена с 1,5% NaCl добавляют 4-часовую бульонную культуру штамма КМ-185 в количестве 1 мл (5·10⁸ микробных клеток в 1 мл) и фаг из расчета множественности инфекции 1:1. Посев культивируют при 37°С в течение 3-суток, после чего стерилизуют через фарфоровые бактериальные фильтры марки Ф-5, контролируют на стерильность и применяют по назначению. Титр фага ФК-85 равен 10⁸-10⁹ частиц в 1 мл.

Обнаружение фагопродукции у штаммов Vibrio metschnikovii на предлагаемом индикаторе КМ-185 обеспечивает дополнительную дифференциацию лизогенных культур от нелизогенных и повышает эффективность лабораторной диагностики V. metschnikovii.

Таблица 1
Обнаружение умеренных фагов среди штаммов V.metschnikoviiШтамм V.metschnikoviiФильтраты из штаммов+штамм индикаторЧисло обнаруженных лизогенных штаммов158181752113596, 14015, 15817, 15993, 15396КМ-185 (Р-14015)++-2+ - фаг лизирует культуру- - фаг не лизирует культуру

Таблица 2Спектр действия и специфичности фага ФК-85 (14015)Вид бактерийV.choleraeV.choleraeeltorV.cholerae с 02-083V.paragemolyticusAeromonasPlesiomonasComamonasEntero bacteriaceaeV.albensisV.metschnikoviiКоличество штаммов253082201113107Из них лизируются ФК-185---------3

Штамм бактерий Vibrio metschnikovii KM-185 выделен из воды при исследовании на вибриофлору. Штамм обладает чувствительностью к специфическому фагу ФК-85, выделенному из штамма бактерий Vibrio metschnikovii 15818, и обеспечивает в качестве штамма-ментора его размножение. Титр фага равен 10⁸-10⁹ частиц/мл. 2 табл.

Штамм бактерий Vibrio metschnikovii KM-185 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), используемый в качестве индикаторной культуры для выявления специфического фага ФК-85 (Центр депонирования бактериофагов РостНИПЧИ).