Способ получения оксикислот или их лактонов Советский патент 1986 года по МПК C12P1/02 A61K35/70 C12P1/02 C12R1/66 

Изобретение относится к способу получения новых лекарственных ве1253432

ществ, обладающих гипохолестереми- ческой активностью, общих формул

о

Шз

О

III

Эти соединения подавляют биосинтез холестерина и могут быть использованы для лечения атеросклероза, гиперлипемии и других подобных заболеваний, а также в качестве проти- вогшесневых агентов.

Оксикислоты или их лактоны получают путем ферментации питательной среды штаммом Aspergillus terreus АТСС № 20542 с последующим выделением соединений из ферментационной смеси экстрагированием растворителем и последовательной хроматографией.

Штамм Aspergillus terreus (обозначенный MF -4845) в собрании культур (фирма Мерк энд Ко,, Шк, Ревей, Нью-Йорк) помещен на постоянное хранение в коллекцию Американского Собрания Видов Культур, 12301, Парка лун , Роквилл, Мэр11пеид 20852 и получил номер по каталогу АТСС № 20542.

Морфологическая характеристика микроорганизмов АТСС № 20542 аналогична морфологическим характеристикам рода Aspergillus. В результате сравнения с известными видами ус та- новлено, что штамм принадлежит виду Aspergillus terreus.

Выращивание этого штамма с целью получения новых соединений осуществляется в водной среде, обычной для получения других продуктов ферментации. Такая среда содержит истоники углерода, азота и неорганичес

кие соли, KOToi«iie устаиваются микрог ,- организмами.

Углеводы, такие как сахара, например глюкоза, фруктрза, мальтоза, сахароза, ксилоза, манитол и т.п., крахмалы, такие как крахмал зерна, например овса, риса, кукурузвьй крахмал, кукурузная мука крупного помола и т.п., можно использовать, как по отдельности, так и в комбинации . в качестве источников усваиваемого углерода в питательной среде. Точное количество источника или источников углеводов, которое используется в среде, зависит частично от других ингредиентов, содержащихся в среде, но в общем случае количество углеводов обычно варьируется в пределах от 1 до 6 вес.% среды. Источники углерода можно использовать по от- дельности или несколько таких источников углерода используется в комбинации. В качестве источников азота в процессе ферментации можно использовать протеиновые материалы. К соответствующим источникам азота относятся, например, гидролизаты дрожжей, первичные дрожжи, мука крупного помола соевых бобов, мука семян хлопка, гидролизаты казеина, насыщенный ликер кукурузы, растворимые вещества из дистиллятора или томатная паста и т.-п. Источники азота используются либо по отдельности, либо в комбинации в количествах от 0,2 до 6 вес.% от веса водной среды.

К питательным неорганическ11М солям, которые можно использовать в среде для выращивания культуры, отнсятся обычные соли, содержащие натрий, калий, аммоний, кальций, фосфа сульфат, хлорид, карбонат и другие подобные ионы. Они также могут содержать следы металлов, таких как кобальт, марганец, железо и магний.

Ферментация осуществляется при 20-37 с. Однако с целью получения оптимальных результатов ферментация осуществляется при 22-ЭО°С. рН питательной среда , предназначенной для культивирования Aspergillus и полу- чения новых соединений, может варьироваться от 6,0 до 8,0.

Хотя новые соединения вырабатываются культурой как на поверхности так и в погруженном состоянии, про- цесс ферментации осуществляется в погруженном состоянии. В небольших масштабах ферментация в общем случа осуществляется при помогди внесения на соответствующую питательную ере- ду культуры Aspergillus и затем, после переноса питательной среды с привитой культурой в среду для продуцирования, ферментация осуществляется при постоянной температуре около 28°С в течение нескольких дней при периодическом встряхивании

Ферментация инициируется в стерилизованной колбе со средой при помощи одной или нескольких стадий развития семян. Питательной средой для стадии семени может быть любая подходящая комбинация источников углерода и азота. Колба с семенами вьщерткивается в камере при постоян- ной температуре около 28°С в течение двух дней при периодическом встряхивании или до тех пор, пока рост не достигнет удовлетворительного уровня и часть полученной в ре- зультате для прививки потомства второй стадии или среды для продуцирования. Колбы с потомством промежуточных стадий, если таконые используются, культивируются по существу тем же способом, т.е. часть содержимого колбы со стадии последнего потомства используется для прививки среды для продуцирования. Колбы с привитой культурой встряхиваются при постоянной температуре в течение нескольких дней, а в конце.периода инкубирования содержимое колб

подвергается центрифугированию или фильтруется.

Для реализации в более значительных масштабах ферментация осуществляется в подходящем резервуаре,снаженном мешалкой и средствами для аэрации средьт (11ерментации. В соответствии с предлагаемым способом питательная среда загружается в резервуар и стерилизуется при помощи нагревания примерно до 120°С. После охлаждения стерилизованная среда прививается предварительно вьфащенными семенами (потомством) продуцирующей культуры и процесс ферментации продолжается в течение, например, 3-5 дней. Одновременно осуществляется перемешивание и/1ши аэрация питательной среды и поддерживается температура примерно 28°С. Этот способ биосинтеза новых соединений предназначен, в частности, для получения больших количеств.

Соединения известным способом выделяются из бульона для ферментации.

Соединения I и II можно подвергнуть гидролизу с основаниями, такими как NaOH, чтобы получить соли, такие как соли натрия соединений III и IV. Используя основания с другими приемлемыми с фармацевтической точки зрения катионами, можно получить соли этих катионов. Аккуратное подкисление солей дает окси- кислоты III и IV, которые можно превратить в соединения I и II при кислотных значений рН. Обрабатывая соединения I и II при помещи кислотного или щелочного катализа с металлометанолом, этанолом, пропано- лом или бутанолом, или с фенил, ди- метиламино или ацетиламино алкано- лами, получают соответствующие сложные эфиры соединений III и IV.

Соединения III и IV (особенно III) можно выделить известным способом без использования хроматографии в форме солей аммония. Такой способ выделения является более удобным и гораздо больше приспособлен для промышленного использования, чем хроматография. Кроме того, соли соединения III и IV являются гораздо более активными, чем соединения I и II в реальных условиях с целью ингибирования процесса биосинтеза холестерина и в качестве противоплесневых агентов. В действительности, оксикислоты (и их соли) являются активными формами. Следовательно, такие соли являются более пред- почт ит ел ькьми, в частности, при использовании в форме доз. Кроме соле аммония; являются и соли тетрамет1т аммония к соли этилендиамина, натрия, калия, , N-метилглюками на, лизина, аргинина и орнитина. Указанные соедине гая являются фармакологически активными соединениями и могут применяться как ле,- карственные препараты стоматическим или парентеральным способом в форме капсул, таблеток, инъекций и т.п В общем случае используется стоматический способ гфименения. Дозы можно варьировать в зависимости от возраста, степени заболевания, веса тела и другик факторов человека, но ежедневная доза дщя возрослого пациента содер 5:ится в области пример- но от 2 до 2000 мг(в предпочтитель- ,ном варианте 2-100 мг)5 которая может быть разделена на две - четыре отдельные доэы. При необходимости можно использовать и более высокие дозы.

Соединения можно также использовать в качестве противоилесневых агентов.

Пример 1. Ферментация.Поп- бирка с лиофилизованной культурой . Aspergillus tsrreus.ATCC № 20542 открывается в стерильных условиях и содерзкимое суспендируется в 250 м колбу Эрленмайера без перегородки (семенная колба I1), содержащую 40 мл среды С, которая имеет следующий состав, г:

Насыщенньп кукурузный ликер 5 Томатная паста 40 Овсяная мука крупного помола 10 Глюкоза 10

Среды элементов смеси ff 2 10 Дистиллированная вода 1000 мл рН 6,8 при помощи NaOH. Колба с привитой культ фой инкубируется в течение 24-48 ч при 28°С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах или амплитуда 5,08 см). Часть (примерно 0,5 мл) содержимого этой колбы затем используется для прививки культуры в наклонной пробирке, содержащей среду Е, Среда Е имеет следующий состав, г: Экстракт дрожжей 4 Солодовый экстракт 10

,

253432

10

Декстроза 4

Агар 20

Дистиллированная вода 1000 мл

рН 7,0 при помощи NaOH.

Наклонная пробирка с привитой культурой инкубируется в течение 11 дней при комнатной температуре. Затем она хранится при в течение 3-4 мес. Часть содержимого этой пробирки затем суспендируется в 250-мидпилитрозую колбу Эрленмайера без перегородки (семенная колба 2), содержащуцз 40 мл среды С. Колба с привитой культурой инкубируется в те- 15 чение 24 ч при 28°С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах, 5.08 см). Приготавливаются шесть колб Зрленмайера емкостью 250 мл без перегородки, содержащих 40 мл среды С. Затем в каждую колбу прививается культура при помощи 2 мл на каждую колбу содержимого семенной колбы 2. Эти шесть колб инкубируются в течение 48 ч при 28°С на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах 5,08 см). Затеям берут шесть двуэс- литровых колб Эрленмайера, содержа- ищх среду F в объеме 500 мл, и в каждую колбу прививается культура при помоп и содерйсимого семенной колбы 3. Среда F имеет следующий сос20

25

30

Насыщенный кукурузный 15 .

Крахма-л СРС 20

Кукурузная мука грубого помола 1

Измельченные соевые бобы 4

Гл;окоза 5

Соевое масло 2,5

(кн,)

КН, РО

.,/..so,

, 0,3

6

12 .

. СаСОз ,Цистшшированная вода 1000 мл

Ji при ПОМОЩИ NaOH.

Колбы с привитой культурой инкубируются в течение 11 дн. без пере- мечшвания при 28°С. После инкубирования в течение 11 дн. бульон подвергается экстрагированию.

Экстрагирование.

Весь бульон рн 6,0 смешивается в смесителе Варинга с тем, чтобы разбить тяжелый слой мицелия, центрифугируется и прозрачный верхний слой декантируется. После фильтра- дии to л фильтрата экстрагируется при помопди 3 л этилацетата, в результате чего получается 1820-мл прозрачного экстракта. Второе экстраги

7

рование при помощи 3 л этилацетата дает 3350 M;I прозрачного экстракта. Твердое вещество бульона экстрагируется при помощи перемешивания в течение 1 ч с использованием 2 л метанола и после фильтрации получается 2100 мл фильтрата.

Порции этих экстрактов сушатся и направляются для анализа. Фильтраты испытываются как ингибиторы фермента редуктаэы HMG-GoA методом, опи- санньм Бегом, Стоником .и Бревером, При этом используются ферменты, полученные в соответствии с описанием, приведенньм Клейнзеком, Рангатамом и Портером. Положительный тест - ин- гибированне составляет более 90% при 20 мкг/мл ICg составляет 2,3 мкг/мл, что указывает на присутствие очень сильного ингибитора синтеза холестерина, действующего на содержание редуктазы HliG-CoA.

Результаты анализа экстракта приведены в табл.1. о.

Таблица

Гель-фильтрация. Весь твердый материал, полученный из первых двух экстрактов, соединяется вместе, растворяется в метаноле и фильтруется с целью удаления нерастворимых твердых частиц, 30 мл фи-льтрата загружается в колонку для гелевой фильтрации

(2, 200 см, 980 мл), заполненную материалом Сефадекс LH-20j и проба фракционируется в соответствии с размером молекул при помощи метанола, который используется в качестве растворителя. Используя индекс преломляемости и данные УФ-анализа , наилучшие фракции определяются при помощи биоаиализа (см.табл.2).

Таблица 2

20

25

253432.S

Выделение и очистка, Проба из фракции 2 предварительно фильтруется через слой в 1 г материала З отерс Бондапак С18 /Пора- 5 зил В и элюируется пятью объемами метанола. Метаноловый элюат концентрируется до 0,5 мл. Эта проба подвергается хроматографии несколько раз на материале Уотерс С 18, 10 из которого изготовлена колонна (3,9 мм 20 см), причем в качестве проявляющего растворителя используется смесь метанол: 0,05 М раствор фосфата аммония, рН 2,9, (75:25). 15 Фракции исследуются на спектрофотометре Бекмана и те фракции, для которых максимум поглощения соответ- . ствует 236 нм с изгибами в 229 и 245 нм, соединяются и концентрируются при пониженном давлении до водного раствора. рН концентрата доводится до 6,5 при помощи 2 М раствора гидрата окиси калия и активные компоненты экстрагируются этилацетатом. Органический слой сушится, концентрируется до сухости и остаток раст- воряется в 0,3 мл метанола. Метаноловый раствор подвергается -хроматографии и рециркулируется. Фракции, содержащие ранее элюированную компоненту, соединяются, концентрируются до водного раствора и экстрагируются хлороформом. Остаток из хлороформа помещается в метанол и растворитель выпаривается в атмосфере азота 3,5 мг высушенного продукта, полученного таким образом, идентифицируется как оксикислота (соединение III).Фракции,содержащие вторую компоненту, соединяются и зкстраги- руются хлороформом. Получено 0,87 мг высушенного продукта, которьп вденти- фицирован как лактон (соединение I).

45 Физико-химические свойства соединения I (MSD-803) приведены ниже: т.пл. 170-171°С, молекулярный вес (масс-спектроскопия) 404; формула - C HjgOs (найдено при помощи масс5Q спектроскопии 402,555, рассчитано 404, 2563), УФ-сдектр (в ацетонит- риле), нм: 230,5 с Е% 505,7; 237,5 с Е% 576,6, 246 с Е% 395,2.

5IMP химические сдвиги. Спектр 5 получен в растворе CDCl (20,1 мг в 0,35 мл). Химические сдвиги приведены относительно внутреннего тетраметилсилана при нуле ррм , при

30

35

40

экспериментальных условиях импульс растворителя (CDCl) имеет место в области 70,0 ррм (долей на миллион). Обнаружено 24 атома углерода, что согласуется с данными масс-спектро- скопии, они имеют следующие химические сдвиги, ррм: 11,5; 13,6; 16,0, 22,6; 24,1; 26,6; 27,2; 30,5; 32,5; 32,8; 35,9; 36,4; 37,1; 38,4; 41,3;

62,4; 67,8; 76,4; 128,4 ; 129,7;

131,7; 133,2; 170,8 и 177,2.

Оптическое вращение.

Характерное оптическое вращение td. 320,7 определяют на растворе 5,30 мг/мл CHjCN. Это значение получено при помощи измерения длины волны линии натрий-D.

На основе этих и других данных можно предположить, что продукт имеет следующую химическую стерео- структуру

ct

/А/

Шз

Соответствующая оксикислота динение III) имеет структуру

П

GHs.i снз 1н.н

Пример 2. Пробирка с лиофи- лизованной культурой Aspergillus terreus АТСС № 20542 .открывается в стерильных условиях и содержимое суспендируется в 250 миллилитровую колбу Эрленмайера без перегородок (семенная колба), содержащую среды С.. Колба с привитой культурой инкубируется в течение 30 ч при на вибраторе, совершающем 220 кол./мин (размах 4,08 см). В 250-миллилитровую колбу Эрленмайера без перегородки, содержащую 40 мл среды G, прививается культура при помощи 2 мл на колбу содержимого сбменной колбы. Среда G имеет следующий состав.

Декстроза 45 Петонизированное молоко 24 Аутолизированные дрожжи 2,5 Полиголиколь Р2000 2,5 мл Дистиллированная вода 1000 мл рН 7,0 при помощи NaOH.

Колба с Привитой культурой инкубируется в течение 120 ч при 28°С на вибраторе,совершающем 220 кол./мин г (размах 5,08 см). После 120 ч инкубирования содержимое колбы подвергается экстрагированию в соответствии с процедурой из примера 1. Общая производительность составляет 21 5 500 ед./мл.

Пример 3. Ферментация. Пробирка с лиофилизованной культурой АТСС f 20542 открывается в стерильных условия и содержимое суспенди- 0 руется в 250 мл колбу Эрленмайера без перегородки (семенная колба), содержащую приблизительно 10 мл среды, которая имеет следующий состав,г

Насыщенный кукурузный ликер 5 5 Томатная паста . 40 Овсяная мука грубого помола. 10 Глюкоза10 Раствор следов элементов 10 0 Дистиллированная вода 1000 мл . рН 6,8 обеспечивается при помощи NaOH.

Раствор следов элементов, мг: FeSO -7H201000

MnSO, 4Н,0 1000

25 100 56

(NH)g Mo. 4Н,о: 19 Q ZnSO -7H20200

Дистиллированная вода (деиони.зи- рованная) 1000 м

Колба с привитой культурой инкубируется в течение 24 ч при 28 С на вибраторе,совершающем 220 кол./мин (размах 5,,08 см). Затем в двухлитровую колбу Эрленмайера без перегородки, содержащую 500 мл среды,прививается культура при помощи 10 мл содержимого первой стадии ферментации из семенной смеси. Эта колба также находится на,вибраторе в течение 24 ч при 28°С.

Б- бак для ферментации из нержа- 5 веющей стали емкостью 200 гал (757 л) загружается 485 л среды, содержащей целлюлозы 4,5 вес/об,, пептонизиро- ванного молока 2,5% вес/об., ауто5

CuClj 2Н20 CaClj 2Н20 НзВОз

11

лизованных дрожжей 0,25 вес/об., полигликоля - Р2000 0,25% об/об. рН среды доводится до 7,0. Содержимое стерилизуется в течение 15 мин при 121°С. Затем в бак заливается один литр содержимого со второй стадии и смесь инкубируется на вибраторе, совершающем 85 кол./мин, в течение 12 ч, затем на вибраторе, совершающем 130 кол./мин в течение 84 ч при 28 С при подаче воздуха со скоростью 5 0,142 в течение.12 ч, а затем со скоростью 10 0,34 в течение 84 ч.

Экстрагирование.

Соединяются две одновременно загружаемые порции в сто гал (378 л) бульона, подкисляются при перемешивании до рН 4,1 при помощи аккуратного добавления 800 мл концентрированной соляной кислоты и экстрагируются добавлением 75 гал (284 л) этилацетата, затем перемешивание продолжается в течение 2 ч.

Затем добавляется примерно 25 футов (11,34 м кг) кремнистого вспомогательного фильтрующего материала и весь полученный шламм пропускается через 61 см фильтр-пресс. Дополнительно 75 гал (284 л) этилацетата используется для промывки спрессованной лепешки и продолжения экстрагирования при noMoopi обращения направления подачи этилацетата через пресс. Эта процедура осуществляется четыре раза. Затем весь промывочный растворитель сливается из пресса и соединяется с первым фильтратом. Двухфазной смеси (фильтрату) дают возможность отстояться и водный слой удаляется. Слой этилацетата промывается, при помощи 10 гал (37,85 л) деионизированной воды, фазам дают возможность разде.ггаться и экстракты этилацетата концентрируются под ва - куумом до примерно 10 гал (37.85 л).

Лактонизация.

Для того, чтобы осуществить циклизацию любого соединения IV в экстракте в соединение II производится следующая азеотропная обработка.

Экстракты этилацетата из дополнительных: 300 гал (1135,5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (113,5 л) бульона добавляются в экстракт и объем снижается до примерно 30 гал (113,5 л) при помощи вакуумной

33432 . 2

дистилляции. Добавляется примерно 50 гал (189-л) толуола и содержимое концентрируется под вакуумом до объема 32 гал (121 л), эта стадия 5 повторяется. Затем добавляется достаточное количество нового толуола, чтобы довести объем до 75 гал (284 л). Без использования вакуума содержимое доводится до дефлегмиро- 10 вания и это состояние поддерживается в течение 2 ч при температуре более .

Этот раствор далее концентрируется под вакуумом до небольшого 15 объема, который затем концентрируется до маслянистого остатка в большом роторном испарителе под вакуумом. Хроматография на силикагеле. Полученные экстракты освобождают- 0 ся от других растворителей добавлением 2 гал (7,5 л) метиленхлорида и повторной концентрацией до масла.

Маслянистый остаток растворяется примерно в 5 гал (18,9 л) смеси этия- 5 ацетат-метиленхлоряд (30/70 об./об), а затем приготавливается шламм при помощи добавления 2,8 кг силикагеля.

Шламм наносится ровным слоем на верхгдаю часть колонны из С1шикагеля Q с размерами 30,5 см 127 см, заполненную той же смесью растворителей.

Элюирование производится смесью этилацетат-метиленхлорид (40/60 об./об.) со скоростью 800 мл/мин,

5 Головной прогон составляет 10 гал (37,85 л), затем собираются фракция каждая объемом в 4 гал (15,141 л). Фракции от 6 до 10 включительно концентрируются под вакуумом до мас лянистого остатка, который растворяется в горячем этилацетате, обрабатывается обесцвеченным углеродом, фильтруется пока горячий и затем охлаждается. Кристаллы MSD 803 (сое5 динение I) выделяются фильтрацией, а маточные растворы концентрируются до масла и подвергаются хроматографии.

Повторная хроматография на сили0 кагеле.

Остаточные маточные растворы из одного и toro же экстракта бульона, эквивалентные по производительности дополнительным 600 гал (2271 л)

5 сьфья для ферментации, соединяются в соответствии с приведенным в растворе метиленхлорида. Половина этого раствора используется для дальней

13

шей хроматографии на силикагеле. Исследование небольшой порции показывает, что общее содержание твердых частиц составляет 325 г. Раствор обрабатывается 40 г обесцвеченного углерода, фильтруется и лепешка промывается метилеихлоридом. Соединенные фильтрат и промывочные растворы концентрируются под вакуумом до маслянистого остатка. Остаток вновь растворяется в 800 мл смеси этилаце тат-метиленхлорид (30-70 об./об,) и раствор превращается в шяамм добавлением 225 г силикагеля. Иламм загружается в верхнюю часть слоя сили каге.ля колонны с размерами 14 35 см заполненной той же смесью, растворителей . Проявление осуществляется смесью этилацетат-метиленхлорид (40/-60 об./об.), Головной прогон, составляющий 3 л, сбрасывается, а затем собираются фракции объемом 800 мл каждая.

Хроматография при обращенно-фа- зовом заполнении.

40 мл из 12 фракциии хроматеграфической процедуры концентрируется до масла весом 500 мг и затем масло вновь растворяется в 5 мл ацетонит- рила. Этот ацетонитрильный раствор загружается в хроматографическую колонну из нержавеющей стали с размерами: внешний диаметр 1,59 см, длина 1,8 м, заполненную препаративной обращенной фазовой жидкостью для колонн хроматографии Бондапак С 18/По разил В, Колонна: злюируется смесью, содержащей 55% об./об. ацетонитрила и 45% и 0,05 М раствора фосфата аммония, рН 3, Объем злюирования между 1360 и 1700 мл собирается иа основе исследования показателя преломления . Органический растворитель удаляется .под вакуу; 1ом и остаточный водный раствор экстрагируется этил- ацетатом. После удаления под ваку. умом зтилацетата остается 120 мг с.оединения, которое кристаллизуется из концентрированного ацетонитрило- вого раствора, в результате чего образуются кристаллы MSD 883 (соединение II), т.пл. 129-131 С, моле- куляриьй вес 406, найдено, при помощи спектроскопии 406, 2706, рассчитано 406, 2719.

Оптическое вращение.

Характерное оптическое вращение

с.3 148,6° определяют на раство32

14

ре 5,23 мг/мл СН,СН. Это значение получено при помощи измерения длины волны линии натрий-D.

с ЯМР химические сдвига (CDClj), ррм:

11,8i 14,9; 16,5; 21,1; 23,Г,

26,7 (2С); 30,9; 31,3; 33,0; 35,7; 35,9; 37,4; 48,5; 38,6; 41,9 (2С);

62,3; 70,1/ 76,5; 131,0; 132,6,

171,2 и 176,7,

На основании этих и других данных можно предположить, что продукт имеет следующую химическую стерео- структуру

НО

v

о

° 44

СНз

СНз Н

Соответствующие оксикислоты (соединение IV) тогда имеет структуру

НО,

А

Н

UHJ H/LH

- CHv

Пример 4, Ингибирование в пробирке редуктазы HMG кофермента А«

Используется модифицированный метод Бега. Модификация заключается в инкубировании фермента с ингибитором в течение 5 мин перед инициированием реакции с субстратом. При работе с такими сильными ингибиторами, какими являются новые соедине- ния стандартная процедура, в соответствии с которой фермент добавляется только в смесь ингибитор-субстрат, дает нелинейную кинетику.

Используя модифицированную процедуру, соль натрия соединения IV дает показатель ICgo ингибированил редуктазы HMG-CoA, равный 2,, по сравнению с 5,4 нения ML 236 В.

г 9

10 И для соедиИнтибирование в реальных условиягх синтеза холестерина (соединение II).

15

Нескольким группам самцов крыс Голтцмана вводится либо 5% эмульфор в соляном растворе, либо испытываемое соединение в эмульфоре через трубку, введенную в желудок. Спустя 1 ч вводится ВП 80 NCi С ацетата / /кг. Затем спустя 50 мин гфоизводит ся анализ кровй крыс и определяется содержания С холестерина, как ме- IAI синтеза холестерина:

Доза, мг/кг йнгибирование,% 38 51 70

5. Сравнение соединений I, II и ML-236B, как ингибиторов синтеза холестерина в клеточной культуре .

Используется моди ящированная процедура А.У. Адбертса и др. для измерения количества биосинтезиро- ванного с холестерина из уксусной кислоты в клетках мышей

0,15 0,6 1:2 П р и м е р

Редактор Н. Бобкова Заказ 4635/60

Составитель В. Романова

Техред в.КадарКорректор-М. Пожо

Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-ЗЗ Раушская каб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое гфедприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

16

253432

L-M в культуре. Испытуемое соединение в 10 мкл диметилсульфоксида добавляется в монослойные культуры с

5 С ацетата. После 3 ч инкубирования клетки омыляются и С холестерин экстрагируется и вьделяет- ся при псмощи тонкослойной хроматографии на силикагеле с использованием смеси петролейный эфир - ди10 этиловый простой эфир-уксусная

кислота (75:25:1). Область на ялас- тинке, соде1якащая С холестерин, устанавливается с использованиеян оставляющего пятна на этой области I,

15 и содержаний с определяется при помощи жидкостного сцинтилляционно- го счетчика.

При помощи этой модифицированной про11едуры устанавливается, что сое20 динение II дает значение 1C для ингибирования редуктазы HMG-CoA, равное 17 да, по сравнению с 22 нм для соединения 1 и 46 нм для соединения ML-236B.