ШТАММ STREPTOCOCCUS LACTIS - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОЦИНА НИЗИНА Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной и микробиологической промышленности.

Известны штаммы Str.lactis продуценты низина [1, 2]
Наиболее близким к предлагаемому является штамм МГУ [3]
Недостатками этого штамма в производстве низина являются низкая продуктивность и недостаточно высокий уровень протеолитической активности.

Задачей изобретения является получение штамма-продуцента низина, обеспечивающего высокий выход целевого продукта, характеризующегося повышенной протеолитической активностью.

Технический результат заключается в получении штамма-продуцента низина, обладающего продуктивностью на уровне 1440-1680 МЕ/см³ч при непрерывном культивировании на средах с высоким содержанием белка.

Штамм Str. lactis 42 хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ВКПМ-6793.

Штамм выделен из сборного сырого молока, полученного от сдатчиков на городском молочном заводе N 2 Санкт-Петербурга в 1990 г.

Для выделения штамма применяли высев на агаризованные среды с чувствительной к низину культурой Bacillus coagulans и отбирали колонии с четкими зонами торможения роста тест-культуры. Выделенные моноклональные изоляты идентифицировали по общепринятой методике на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков. Изоляты, идентифицированные как виды Str. lactis, исследовали на способность к биосинтезу низина, фагочувствительность и протеолитическую активность и отбирали варианты, обладающие наибольшей способностью к образованию низина, устойчивостью к поливалентному фагу и высокой протеолитической способностью.

Предлагаемый штамм Str. lactis 42, наиболее активный из отобранных, исследовали как продуцент низина в процессе управляемого непрерывного культивирования.

Морфологические признаки. Клетки сферической формы представляют собой моно-, дипло- и стрептококки в зависимости от возраста. Размер клеток в диаметре 0,5-1,0 мкм. Грамположительные, неподвижные; спор, капсул и пигментов не образуют.

Культуральные признаки. На плотной питательной среде (гидролизованное молоко с 2% агара Дифко или сывороточный агар) образуют мелкие выпуклые блестящие колонии белого цвета с ровными краями диаметром до 0,6 мм. В бульоне образует равномерную муть. Оптимальная температура роста 29-32^оС, растет при 10^оС и не растет при 45^оС. Молоко свертывает за 13-14 ч, предельная титруемая кислотность в молоке 100^оТ. Лакмусовое молоко свертывает и обесцвечивает. Желатину не разжижает. Оптимальное значение pH 6,7-6,8. Не растет в бульоне с 6,5% NaCl или при pH 9,6.

Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб. Брожение гомеферментативное. Образует правовращающую молочную кислоту. Штамм образует аммиак из аргинина, сбраживает глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу сахарозу, мальтозу, маннозу, маннит, арабинозу, ксилозу, слабее декстрин, не сбраживает рамнозу, сорбит, раффинозу. Азот использует в аминной форме.

Фагоустойчив. Содержание Г+Ц равно 33-42 мол.

Характеризуется повышенной протеолитической активностью и способен интенсивно синтезировать низин на средах с высоким содержанием белка. Протеолитическая активность, выраженная по тирозину, составляет 3,4-5,7 мг%
Культура хранится в сублимационно-высушеном состоянии в ампулах при температуре 2 ± 6^оС не менее 12 мес.

Использование штамма Str. lactis 42 иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Штамм Str. lactis 42 восстанавливают путем переноса содержимого ампулы в пробирку со стерильным обезжиренным молоком. Посевы инкубируют при температуре 30^оС. Из восстановленной культуры выращивают инокулят на стерильном обезжиренном молоке. Инокулят вносят в ферментационную срезу в количестве 5%
Условия ферментации.

Состав питательной среды, Сухая молочная сыворотка 4 Дрожжевой автолизат 5 Цитрат натрия 1 Вода дистиллированная до 1 л
Процесс ферментации осуществляют в периодических условиях при температуре 30^оС и pH 6,8 до достижения начала стационарной фазы роста культуры, что составляет 12 ч. Непрерывное культивирование продуцента проводят при скорости разбавления Д=0,30 ч^-1, при этой скорости биосинтез низина стабилизируется на уровне А=4800 МЕ/см³. Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет
П=АхД=1440 МЕ/см³ч.

В этих же условиях известный штамм Str.lactis МГУ показал продуктивность 960 МЕ/см³.ч.

П р и м е р 2. Осуществляют аналогично примеру 1. Ферментацию в периодических условиях проводят в течение 13 ч, после чего начинают непрерывный процесс со скоростью разбавления 0,40 ч^-1, при этом биосинтез низина штаммом-продуцентом стабилизируется на уровне 4200 ед/см³. Продуктивность пpоцесса при указанных параметрах составила 1680 МЕ/см³ч.

В этих же условиях известный штамм Str.lactis МГУ показал продуктивность 1120 МЕ/см³ч.

П р и м е р 3. Протеолитическую активность известного и предлагаемого штаммов определяли двумя методами: колориметрическим с реактивом Фолина (по тирозину) (1) и методом казеиновой преципитации по Сэндвику (2). Последний заключается в образовании белых зон вокруг лунок с культурой штамма на среде с казеинатом натрия. Диаметр зон зависит от активности протеиназ молочных культур.

В таблице приведены сравнительные данные по протеолитической активности известного и предлагаемого штаммов.

Таким образом, использование предлагаемого низинообразующего штамма Str. lactis 42 возможно при получении низина непрерывным способом, так как он характеризуется высокой продуктивностью и стабильностью биосинтеза бактериоцина в условиях длительного непрерывного культивирования; повышенной протеолитической активностью, что позволяет выращивать его на средах с высоким содержанием белка.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет новый штамм Streptococcus lactis 42 (ВКПМ-6793) - продуцент бактериоцина низина, обеспечивающий стабильный биосинтез целевого продукта в процессе управляемого непрерывного культивирования (продуктивность на уровне 1440-1680 МЕ/см³ч) и характеризующийся повышенной протеолитической активностью.

Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-6793 продуцент бактериоцина низина.