ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ТРАС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ТЕТРАЦИКЛИНУ, РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ, СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения генетически измененных вариантов пробиотиков, с сохранением ингибирующих свойств к Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Pseudomonas (Burkcholderia) pseudomallei. Штамму присвоен номер КМ-116 и он депонирован в Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб".

В последние годы в терапии инфекционных заболеваний достаточно широко используют пробиотики - препараты, в состав которых входят животные микроорганизмы (естественные обитатели кишечного тракта человека) или сапрофиты, обитающие во внешней среде. В отличие от антибиотиков они совершенно безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для клинического применения.

Использование для конструирования пробиотиков микроорганизмов из рода Bacillus (чаще, B. subtilis) привело к созданию некоторых эффективных препаратов (бактисубтил, бактерин-СЛ, биоспорин, споробактерин, споролакт, бификол и др.), которые применяют в США, Италии, Югославии, Германии, Франции, Китае, Украине и сравнительно недавно в России (Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В. А. и др. "Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus", Микробиол. журнал, 1993, т.55, N 4, с.92-112; Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Афонская С. В. , Смирнов В.В "Серологический ответ микроорганизма на патогенные бактерии под влиянием пробиотиков из бацилл", Микробиол. журнал, 1993, т.55, N 5, с. 81-83).

Возможность создания новых пробиотиков, совершенствование существующих, а также их более широкое использование для лечения и профилактики инфекционных заболеваний (в том числе особо опасных), дисбактериоза и других нарушений деятельности желудочно-кишечного тракта представляет актуальную задачу.

В инструкциях по применению "Споробактерина", утвержденных решениями Комитета медицинских иммунобиологических препаратов фармкомитета России от 15.10.92 г. и зам.начальника Главного управления ветеринарии от 31.07.92 г. имеется упоминание о том, что поскольку бактерии штамма сенной палочки высокочувствительны к антибиотикам, то "одновременное введение антибиотиков и других антибактериальных препаратов, особенно через рот, резко снижает эффективность споробактерина".

Целью изобретения является получение штамма B.subtilis, обладающего множественной лекарственной устойчивостью (Rif^r, Ap^r, Str^r, Tc^r) с сохранением ингибирующих свойств к B.antgracis (возбудителю сибирской язвы), V. cholerae (различным типам возбудителя холеры), Y.pestis (возбудителю чумы), P. pseudomallei (возбудителю мелиоидоза), а также культурально-морфологических и биохимических свойств, характерных для штамма прототипа B.subtilis 534, являющегося основой препарата "споробактерин" фирмы "Бакорен", г. Оренбурга.

Для получения антибиотикорезистентных вариантов B.subtilis с помощью методов селекции (Браун В. "Генетика микроорганизмов". Изд. "Наука", М., 1968, с. 134-139) на градиентных пластинках и с помощью различных рекомбинационных процессов (Прозоров А. А. "Генетическая трансформация и трансфекция". Изд. "Наука", М. , 1980, с.124-129; Battisti L., Green B.D., Thorne C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. J.Bacteriology, 1985, V.162, N 2. P.543-550). В качестве исходного (реципиентного) был использован штамм B.subtilis 534 с антимикробным эффектом против патогенной микрофлоры. В качестве донорных культур для осуществления рекомбинационных процессов были использованы маркерные штаммы микроорганизмов (табл. 1).

Предварительно, на α- агаре (среда Луриа) с дозами 2,5; 5; 10 мкг/мл антибиотика у штамма B.subtilis 534 был определен уровень чувствительности (резистентности) к различным, наиболее употребляемым в настоящее время в клиниках, десяти антибиотикам: ампициллину (Ap); бензилпенициллину (Bp); тетрациклину (Tc); стрептомицину (Str); хлорамфениколу (Cm); эритромицину (Em); рифампицину (Rif); канамицину (Km); ристомицину (Ris); карбинициллину (Car).

У штамма B. subtilis 534 выявлены единичные клетки популяции бацилл, устойчивые к 10 мкг/мл Str. К остальным антибиотикам B.subrilis 534 была чувствительна.

С высокой частотой выявляются в популяции B.subtilis на градиентных пластинках и Rif^r варианты. При этом устойчивость 10 мкг/мл антибиотика в крови (ликворе) кумулируется крайне редко (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., Медицина, 1982, с.495).

Ампициллинрезистентность (т. е. синтез β- лактамазы) у B.subtilis получена с помощью генетических рекомбинационных процессов и имеет ряд особенностей, характерных для резистентности к данному антибиотику - у варианта B. subtilis ТРАС-синтез β- лактамазы носит явный индуктивный характер с выраженностью "эффекта массы", т.е. высев малого количества спор или вегетативных клеток этого варианта на среду, содержащую 5-10 мкг/мл ампициллина, из-за малого пула не могут расти на такой среде. В то же время, высев свежей бактериальной массы (вегетативных клеток) этого варианта B.subtilis на среду, содержащую даже больше 10 мкг/мл ампициллина, дает прирост клеток с четким фенотипическим проявлением.

При конструировании пробиотиков с требуемыми свойствами перспективный штамм должен сочетать антагонистическую активность по отношению к заданному набору патогенных культур с достаточной устойчивостью к неблагоприятным условиям среды (в данном случае устойчивость к антибиотикам).

Пример 1. Испытание генетически маркированного штамма B.subtilis ТРАС по проявлению антибиотикорезистентности в сравнении с исходным штаммом - прототипом B.subtilis 534.

Предварительно обе культуры B.subtilis высеваются в пробирки с L-бульоном (фирма "Дифко"). Культуры бацилл подращиваются при 37^oC в течение ночи (12-18 ч). Затем бульонные культуры бактериологической петлей высевают бляшками (штрихами) на сектора L-агара с антибиотиками (Rif^r, Ap^r, Str^r, Tc^r) по 10 мкг/мл и без них. Культивирование посевов на L-агаре при 35-37^oC осуществляют в течение 3 сут. Учет результатов роста испытуемой и контрольных культур на средах с различными антибиотиками проводят через 48-72 ч.

На средах с антибиотиками Ap10 и Rif10 растет только культура B.subtilis ТРАС; на среде с St10 - также B.subtilis ТРАС и иногда единичные колонии B. subtilis 534, в то время как на L-агаре без антибиотика растут оба штамма: B.subtilis ТРАС и B.subtilis 534.

На среде с антибиотиками Tc10 растет B.subtilis ТРАС, в то время как B. subtilis 534 к TC10 чувствителен, т.е. рост отсутствует.

Пример 2. Определение антагонистической активности бацилл B.subtilis ТРАС и прототипа B.subtilis 534 по отношению к патогенным микроорганизмам (табл. 2) осуществляли с помощью теста "отсроченного антагонизма" (Константинов Г. Лизоцим. Определение активности лизоцима //Экспериментальная микробиология /Под ред. С. Бырдарова. - София: Медицина и физкультура, 1965, с.327), модифицированного нами.

Для определения антибактериальной активности бацилл B.subtilis ТРАС и B. subtilis 534 делали посев бляшками (3-4 мм в диаметре) взвеси спор испытуемых культур на сектора чашек с BH1 (фирмы "Дифко") агаром (количество засеянных чашек должно соответствовать количеству индикаторных культур - т.е. 6). Бляшки подращивали при 37^oC в течение 48-72 ч (размеры их увеличиваются до 15-25 мм в диаметре). Чашки с выросшими бляшками подвергали обработке парами хлороформа - для этого в крышку каждой перевернутой чашки с бляшками добавляли 15-20 капель хлороформа и затем помещали их в эксикатор с крышкой (хлороформирование должно осуществляться не менее 2-х ч, но можно сутки и более). Затем чашки вынимали из эксикатора, проветривали от паров хлороформа.

В расплавленный и остуженный до 45^oC 0,5% BH1 агар (по 3 мл в пробирке) засевали 0,1 мл суточной бульонной культуры 1-6 (табл. 2) и наносили (раскатывали) на поверхности BH1 агара с хлороформированными бляшками, но так, чтобы 0,5% BH1 агар не попал на поверхность бляшек, а только соприкасался с их краями. Чашки с посевами культур B.anthacis, V.cholerae, P.pseudomallei помещали в термостат на 24 ч при 37^oC, а Y.pestis EV - при 28^oC.

Учет результатов "отсроченного антагонизма" B.subtilis ТРАС и B.subtilis 534 по отношению к культурам возбудителей особо опасных инфекций осуществляют в течение 2 сут по зонам просветления (лизиса) газонов вокруг бляшек B. subtilis.

В данном примере антагонистическая активность B.subtilis ТРАС по отношению к патогенным видам микроорганизмов (табл. 2) в тесте "отсроченного антагонизма" проявляется же как и у B.subtilis 534.

Таким образом, представленный штамм B.subtilis ТРАС-КМ-116 проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладает множественной (Rif^r, Ap^r, Str^r, Tc^r) лекарственной устойчивостью, что позволяет конструировать на его основе антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии.

Изобретение предназначено для получения пробиотика на основе нового штамма Bacillus subtilis. Штамм В. subtilis ТРАС -КМ- 116 проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов B. anthracis (возбудителю сибирской язвы), V. cholerae (различным типам возбудителя холеры), Y.pestis (возбудителю чумы), Ps. pseudomallei (возбудителю мелиоидоза). Штамм также обладает множественной (Rif^r, Ар^r, str^r, Тc^r) лекарственной устойчивостью. Штамм позволяет конструировать на его основе высокоактивный антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии. 2 табл.

Штамм Bacillus subtilis ТРАС-КМ 116 (Российская коллекция патогенных бактерий "Микроб"), резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину, стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов.