СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТОМИЦИНРЕЗИСТЕНТНЫХ ВАРИАНТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ИЗ СИМБИОТИЧЕСКОЙ СМЕСИ КЛЕТОК BACILLUS ANTHRACIS И СКОЛЬЗЯЩИХ БАКТЕРИЙ - MYXOCOCCUS XANTHUS Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителя сибирской язвы.

На территории Российской Федерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья находится значительное количество неблагополучных по сибирской язве регионов (1). В России ежегодно регистрируются случаи заболевании людей и животных сибирской язвой и, соответственно, выявляются очаги с различной эпидемиологической и эпизоотологической активностью (2). Особую актуальность возбудитель сибирской язвы приобрел после использования спор B.anthracis в качестве объекта биологического терроризма (3).

Ведущее место при экстренной профилактике и лечении данного заболевания принадлежит антибиотикам широкого спектра действия, таким как стрептомицин или его сочетания с другими лекарственными средствами (4, 5).

Однако широкое применение антибиотиков создает серьезные проблемы, в частности формирование лекарственно-устойчивых штаммов бактерий.

Понятие лекарственной устойчивости применяют в более широком и более узком смысле. В последнем случае подразумевают только приобретенную устойчивость, т.е. состояние, являющееся результатом возникновения нового признака у микроорганизма. Такой признак закодирован в наследственном аппарате бактерии, но может быть утрачен без изменения комплекса остальных признаков, например, характеризующих ее патогенность или ее таксономическое положение. В противоположность этому природная нечувствительность вида или штамма микроорганизма основана на морфологических или функциональных особенностях бактерии, в силу которых ее метаболические центры не доступны или не уязвимы для препарата. Так, например, относительная природная нечувствительность микроорганизма, основанная на особенностях структуры ее оболочки, затрудняет доступ антибиотика к чувствительному субстрату. Такие особенности неотделимы от таксономического своеобразия вида и возникли в его эволюции независимо от контакта с антибиотиком.

Комитет экспертов ВОЗ одобрил два определения устойчивости бактерий к лекарственным препаратам (6). Первое из них ориентируется на потребности клиники. Микроорганизм признается устойчивым, если он может переносить действие препарата в концентрации, которая превышает возможный уровень его содержания в тканях организма. Второе определение имеет бактериологическую направленность. Микроорганизм признают устойчивым, если он переносит действие препарата в более высокой концентрации, чем другие штаммы микроорганизма того же вида.

Концентрация стрептомицина в сыворотке крови человека при внутримышечном введении терапевтических доз препарата составляет всего 5-10 мкг/мл (7). Минимальная подавляющая концентрация (МПК) стрептомицина для обычных (чувствительных) штаммов B.anthracis колеблется от 0,25-10 мкг/мл. Появление в популяции B.anthracis клонов, устойчивых к антибиотику, представляет серьезную проблему в лечении и экстренной профилактике сибиреязвенной инфекции.

В генетике микроорганизмов различают два типа устойчивости к ингибиторам (антибиотикам) бактерий - стрептомициновый и пенициллиновый (8).

Устойчивость к стрептомицину.

Микроорганизмы, приобретающие устойчивость различного уровня к ингибиторам роста в результате одной ступени отбора, характеризуются стрептомициновым типом резистентности. Выделение таких мутантов происходит при обработке популяции, состоящей преимущественно из чувствительных клеток, ингибирующим агентом: стрептомицином или фагом, изониазидом, аминосалициловой кислотой, валином и др. При этом мутанты приобретают максимальную устойчивость к ингибирующему агенту на первой ступени отбора. К большинству же антибиотиков получить высокоустойчивые мутанты на первой ступени отбора не удается, и для их выделения требуется ступенчатый отбор мутантов, устойчивых к повышающимся концентрациям ингибитора - это пенициллиновый тип резистентности. Такой тип устойчивости характерен для многих антибиотиков - хлорамфеникола, неомицина, террамицина и т.д.

В лабораторной практике при высеве взвеси спор B.anthracis в концентрации 10⁹ в мл на среду, содержащую, например, 100 мкг/мл стрептомицина, иногда можно обнаружить мутанты, устойчивые к наивысшей концентрации стрептомицина и мутанты, устойчивые к 100 мкг/мл этого антибиотика, и даже такие, которые, как выясняется, при последующем субкультивировании являются стрептомицинзависимыми. При этом частота мутантов, устойчивых к различным концентрациям стрептомицина, различна. Согласно современным представлениям возникновение мутантов с различной степенью устойчивости к стрептомицину обусловлено мутациями локусов генов, расположенных в различных участках генома клетки данного микроорганизма, а локус стрептомицинзависимости является тесно сцепленным с геном, детерминирующим стрептомицинрезистентность.

В клинической практике устойчивые к антибиотикам мутанты бактерий могут возникать в организме больных при лечении антибиотиками и даже у персонала лечебных учреждений, подвергавшегося действию аэрозолей, содержащих низкие концентрации антибиотиков (8). Так, общеизвестны эпидемические проблемы, когда стрептомицин и изониозидустойчивые штаммы достаточно часто выделяли от больных, принимавших эти препараты.

Чтобы избежать нежелательного появления антибиотикоустойчивых штаммов, необходимо использовать сразу два антибиотика, особенно в том случае, когда один из них - стрептомицин.

Возбудитель сибирской язвы наряду со способностью образовывать споры обладает и другими адаптационными механизмами, которые могут обеспечивать существование его в почве. Метаболический аппарат B.anthracis при попадании клетки в почву способен быстро включать резервные адаптационные системы, дающие микроорганизму возможность при определенных условиях осуществлять репродукцию и тем самым значительно увеличивать численность микробной популяции (9). Таким образом, B.anthracis имеет не только паразитическую фазу развития, находясь в организме животного или человека, но также сапрофитическую, персистируя в почве и на длительный период становясь сочленом почвенного биоценоза, т.е. сапрозоонозом (10).

Для доказательства сапрофитической природы возбудителя сибирской язвы возможно применение методологии экологического представления о стратегии отбора микроорганизмов. Под стратегией отбора по Работнову Т.А. (11) необходимо понимать “совокупность приспособлений, обеспечивающих виду возможности обитать совместно с другими организмами и занимать определенное положение в соответствующих биоценозах”.

Известно, что патогенные почвенные микроорганизмы (возбудители сапронозов) находятся в симбиотических взаимоотношениях с различными сапрофитами, к которым относится и представитель скользящих бактерий Myxococcus xanthus. Этот убиквитарно распространенный микроорганизм подробно охарактеризован в кратком определителе бактерий Берги (12). M.xanthus формирует популяцию, состоящую из клеток с различными физиологическими функциями. При этом микобактерии никогда не существуют как отдельные клетки, а формируют многоклеточные образования в виде плодовых тел. Клетки популяции миксококков секретируют тяжи слизи - “струи”, которые направляют движение совокупности клеток. Такая колония (плодовое тело) окружает клетки гетерологичных микроорганизмов и заключает их в своеобразные складки, называемые “карманами”. В них происходит как питание миксококков продуктами метаболизма захваченных клеток, так и сохранение последних.

Миксобактерии чаще всего встречаются в почве; они растут на разлагающемся растительном материале - траве, листьях, коре живых деревьев или помете животных. Есть виды миксобактерий, обитающих в водной среде (12).

Применение методологии экологического понятия о стратегии отбора микроорганизмов (11) для решения центрального вопроса, учения о сапронозах относительно места возбудителей этих инфекций в почвенных биотах, позволяет считать вполне возможным совместное обитание B.anthracis и M.xanthus как К-стратегистов. M.xanthus при этом обладает множественной лекарственной устойчивостью, в том числе и стрептомицинрезистентностью.

Моделирование возможного сохранения и распространения B.anthracis в плодовых телах M.xanthus, а также разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами, осуществлены нами ранее (13, 14).

Совместное существование микроорганизмов в различных экосистемах привело к естественному клонально-селекционному механизму поддержания и сохранения вида бактерий в природе. И именно внутривидовое и межвидовое многообразие микроорганизмов, а точнее генотипический и фенотипический полиморфизм, обусловил возможность осуществления генетических рекомбинационных процессов в различных экологических нишах. Все генетические процессы в природе: возникновение мутантов, адаптивная изменчивость и др. происходят “спонтанно” (15). “Спонтанными” в биологии называют события (16), причина которых неизвестна. Так, спонтанной трансформацией (17) называют трансформацию, происходящую при совместном выращивании штаммов, обладающих разными признаками, или при контакте клеток одного штамма с культуральной жидкостью другого. Впервые это явление на модели особо опасной инфекции (ООИ) - возбудителя мелиоидоза, было открыто нами еще в 1973 году, а спонтанный генетический процесс трансформации в почве у этого микроорганизма - несколько позже (18).

Чтобы вычислить мутанты, высокоустойчивые к антибиотику, необходимо прежде всего определить уровень чувствительности данного штамма микроорганизма к этому ингибитору, т.е. ту наивысшую концентрацию антибиотика, при которой еще удается обнаружить выжившие клетки популяции. Затем, осуществляя высев микроорганизма на среды с последовательным увеличением концентрации антибиотика в среде, можно выделить мутанты с очень высоким уровнем устойчивости (8). Этот метод (прототип нашему способу получения Str^R вариантов) громоздок и не оправдывает себя, особенно в том случае, когда нас не интересует, какие концентрации антибиотика используются на каждой ступени отбора (8). Эффективность такой методики можно несколько упростить, используя метод “градиентных пластинок”, описанный Szybalski W. (19). Однако он используется для получения мутантов, устойчивых к антибиотикам по пенициллиновому типу, и, кроме этого, он не позволяет выявить клоны, устойчивые к стрептомицину в симбиотической смеси клеток при спонтанной генетической рекомбинации.

Целью настоящего изобретения является моделирование спонтанного генетического процесса и на его основе создание способа выявления и получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителя сибирской язвы в симбиотической смеси клеток B.anthracis и скользящих бактерий M.xanthus.

Для достижения поставленной цели предварительно на поверхность плотной питательной среды агара Луриа без антибиотика в чашках Петри наслаивают мембранные фильтры (Владипор - марки МФА - №4, либо Сынпор с диаметром 35 мм). Скрещивание стрептомицинчувствительного штамма B.anthracis с M.xanthus осуществляют (см. пример №1) путем смешивания по стандартной бактериологической петле биомассы клеток этих микроорганизмов и рассева смеси на поверхности фильтров, наслоенных на агар Луриа. Контролями при этом служат разделительные посевы биомасс B.anthracis и M.xanthus. Инкубацию посевов проводят в термостате при 35°С в течение 20-24 ч. Последующую репликацию выросших колоний (популяций) осуществляют на селективной среде, содержащей 100 мкг/мл стрептомицина и инкубируют отпечатки колоний при 35°С в термостате в течение 48-72 ч.

У выросших на среде со стрептомицином колоний B.anthracis определяют уровень стрептомицинрезистентности путем высева их на среды с последовательно повышающимися в два раза дозами стрептомицина.

Стрептомицинзависимость стрептомицинрезистентных клонов определяют путем последующего субкультивирования их на питательной среде без антибиотика.

Использование симбиотических взаимоотношений между патогенным микроорганизмом (B.anthracis) и сапрофитом (M.xanthus), а также спонтанного рекомбинационного процесса у этих партнеров, позволяет получить стрептомицинрезистентные варианты B.anthracis из симбиотической смеси клеток аналогично выявлению антибиотикорезистентных клонов, например спонтанной трансформации посредством плазмидной ДНК (20). Однако для осуществления генетической трансформации на модели B.anthracis необходимо использовать громоздкий метод криотрансформации (21), поскольку клетки B.anthracis не обладают естественной компетентностью.

ПРИМЕР №1

Для скрещивания клеток стрептомицинчувствительного штамма B.anthracis СТИ Str^S с M.xanthus смешали по стандартной бактериологической петле биомассы клеток этих микроорганизмов и рассеяли по поверхности мембранного фильтра (Владипор - марки МФА-№4), наслоенного на агар Лурия без стрептомицина. Контролями при этом служили аналогичные раздельные посевы биомасс B.anthracis СТИ StS2

В последующем осуществили репликацию (отпечатки) выросших популяций на фильтрах, на селективную среду, содержащую 100 мкг/мл стрептомицина и инкубировали отпечатки колоний при 35°С в термостате в течение 48 ч. Затем осуществили отбор Str^R колоний на Луриа агар, содержащий стрептомицин.

ПРИМР №2

Для определения уровня резистентности к стрептомицину (Str) исходных штаммов B.anthracis СТИ и Davies; стрептомицинрезистентных (Str^R) вариантов, полученных селективным путем; Str^R вариантов, полученных с помощью трансдукции; а так же Str^R вариантов, выделенных из симбиотической смеси клеток B.anthracis и M.xanthus, использовали:

1. B.anthracis СТИ - исходный бескапсульный (токсигенный) вариант;

2. B.anthracis СТИ Str^R R - стрептомицинрезистентный, шероховатый клон, полученный селекционным путем;

3. B.anthracis СТИ Str^R S_N - стрептомицинрезистентный гладкий клон, полученный селекционным путем;

4. B.anthracis СТИ Str^r - Тд R а)* №3 - шероховатый стрептомицинрезистентный трансдуктант - ализогенный;

5. B.anthracis СТИ Str^R Тд R L)** №8 - шероховатый стрептомицинрезистентный трансдуктант - лизогенизирован трансдуцирующим фагом;

6. B.anthracis СТИ Str^R Тд S - стрептомицинрезистентный трансдуктант в S-гладкой форме;

7. B.anthracis СТИ Str^R Тд S б/м стрептомицинрезистентный трансдуктант в S-гладкой форме, пассирован через белую мышь.

8. B.anthracis Davies S₃₂ - исходный капсулированный (атоксигенный) вариант;

9. B.anthracis Davies S₃₂ Str^R (M.x) №3 - стрептомицинрезистентный вариант, выделен из симбиотической смеси B.anthracis и M.xanthus.

10. B.anthracis Davies S₃₂ Str^R (M.x) №5 - стрептомицинрезистентный вариант, выделен из симбиотической смеси B.anthracis и M.xanthus.

11. B.anthracis СТИ Str^R (M.x) №1 стрептомицинрезистентный вариант, выделен из симбиотической смеси B.anthracis и M.xanthus.

12. B.anthracis СТИ Str^R (M.x.) №2 стрептомицинрезистентный вариант, выделен из симбиотической смеси B.anthracis и M.xanthus.

Субклоны изовариантов штаммов B.anthracis 1-12 посеяли на сектора чашек с агаром Хоттингера, содержанием Str - 100; 200; 500; 1000; 2000 мкг/мл, Инкубировали посевы при 35°С в течение 72 ч. Учет результатов приведен в таблице.

При анализе результатов опыта №2, приведенных в таблице, обращает на себя внимание одинаковый уровень резистентности (более 1000 мкг/мл Str) Str^R вариантов, полученных методом селекции (№2 и №3); методом трансдукции (№№4, 5, 6, 7) и Str^R варианты, выделенные из симбиотической смеси клеток B.anthracis и M.xanthus (9, 10, 11, 12). При этом на уровень стрептомицинрезистентности мутантов (рекомбинантов) не повлияла диссоциативная форма S или R (т.е. наличие капсулы или ее отсутствие); ализогения или лизогенность варианта и даже пассаж через организм белой мыши.

ПРИМЕР №3

Для выявления стрептомицинзависимости стрептомицинрезистентных вариантов B.anthracis субклоны изовариантов штаммов 1-12 (см. табл. в Примере №2) высеяли на сектора Луриа агара (La) без Str. Инкубировали посевы при 35°С в течение 72 ч. Учет результатов приведен в таблице (пример №2).

Как свидетельствуют результаты опыта, стрептомицинзависимость проявляется (отсутствие роста на аХотт и La) только у стрептомицинрезистентных вариантов (№№9, 10, 11, 12), выделенных из симбиотической смеси клеток B.anthracis и M.xanthus, а исходные варианты B.anthracis (1 и 8), а также Str^R варианты, полученные методом селекции и трансдукции (2-7) интенсивно растут на среде Хоттингера и среде Луриа без Str.

Таким образом, преимущества предлагаемого способа получения Str^R вариантов B.anthracis при создании банка маркированных культур по сравнению с селекционным методом получения Str^r мутантов (- прототипом) или рекомбинационным (- аналогом), заключаются в следующем:

1. Предлагаемый способ более прост, не требует специальной аппаратуры, не требует набора генетически маркированных исходных вариантов микроорганизмов для передачи требуемого признака, а полученные антибиотикорезистентные штаммы обладают таким же уровнем устойчивости, как полученные селективным и рекомбинационным путем, но обладают дополнительным полезным признаком стрептомицинзависимости;

2. Поскольку Str^R варианты B.anthracis, полученные предлагаемым способом, обладают в то же время и стрептомицинзависимостью (Str^D) и эти свойства опосредованы (наведены) повсеместно распространенным (убиквитарным) сапрофитом M.xanthus, можно предполагать возможность аналогичного спонтанного рекомбинационного процесса в природе.

Литература

1. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М.: ВУНМЦ М.З. РФ. - 1999. - С. 320-344 (447 с.).

2. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов//Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №2. - С. 48-52.

3. Jnglesby Т., O. Toole Т., Henderson D.et al. Anthrax as a biological weapon, 2002 JAMA.2002; 287; 2236-2252.

4. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности: Санитарные правила. - М.: Информационно-издательский центр Госкомсанэпиднадзора России. – 152 с. (С. 42-43).

5. Проскурина В.А., Гребенкина М.Б., Буравцева Н.П. и др. Сравнительная терапевтическая эффективность антибиотиков и химиопрепаратов при сибирской язве в эксперименте//Актуальные вопросы профилактики особо опасных инфекционных заболеваний: материалы науч.-практ. конф. 60 лет противочумной службы Кавказа. - Ставрополь, 1995. - С. 218-220.

6. Соловьев В.Н. Стратегия современной химиотерапии бактериальных инфекций. - М. Медицина, 1973, 320 с.

7. Навашин С.М. Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. - М.: “Медицина”, 1982, С. 216-236.

8. Браун В. Генетика бактерий. - М. “Наука”, 1968, С. 134-145.

9. Соркин Ю.И., Родзиковский А.В. Экология сибиреязвенного микроба в естественных биоценозах почв различных природных зон СССР//Экология возбудителей сапронозов. - М., 1988, с. 65-79.

10. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах//Экология возбудителей сапронозов. - М., 1988, с. 20-34.

11. Работнов Т.А. Бюл. МОИП. Отд. биол. - 1975. - №30, №2. - С. 5-11.

12. Хоуат Дж. Краткий определитель Берги. Скользящие бактерии. - М.: Изд-во “Мир”, 1980. - С. 49-53.

13. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Моделирование возможного сохранения и распространения Bacillus anthracis во внешней среде //Матер. юбилейной конференции, посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С. 356-357.

14. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами. Природно-очаговые ООИ, их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань, 2001, с. 226-228.

15. Чернощеков К.А., Лепехин А.В., Чернощеков М.А. Эволюционный механизм возникновения “спонтанных” мутаций микробов//Природноочаговые инфекции в России. Омск, 1988, с. 23-24.

16. Рингерц Н., Сэвидж Р. Спонтанное слияние клеток - гибридные клетки - М.: Мир, 1979. - 415 с.

17. Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция. - М.: Наука, 1980. - С. 157-164.

18. Буланцев А.Л., Лозовая Н.А. Спонтанная генетическая трансформация у Pseudomonas pseudomallei//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1985, №9. - С. 11-14.

19. Szybalski W., Bryson V. Developments in industrial microbiology//J. Bacteriol. - 1952, №64. - Р.489.

20. Глумова Е.Ф., Прозоров А.А. Спонтанная трансформация посредством плазмидной ДНК у Bacillas subtilis. - Докл. АН СССР - 1979. - Т.246, №3. - С. 728-730.

21.Пузанова О.Б. Криотрансформация возбудителя сибирской язвы плазмидной ДНК: Дисс. Канд. мед. наук, Саратов. 1990, 147 с.

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителя сибирской язвы. На поверхность плотной питательной среды наслаивают мембранные фильтры. Скрещивание стрептомицинчувствительного штамма B.anthracis с M.xanthus осуществляют путем смешивания биомассы клеток этих микроорганизмов и рассева смеси на поверхности фильтров, наслоенных на поверхность питательной среды. Контролями при этом служат раздельные посевы биомасс B.anthracis и M.xanthus. Посевы инкубируют в термостате при 35°С в течение 24 ч. В последующем репликацию (отпечатки) выросших популяций осуществляют на селективной среде, содержащей 100 мкл/мл стрептомицина и инкубируют отпечатки колоний при 35°С в течение 48-72 ч. Способ позволяет выявить и получить стрептомицинрезистентные варианты возбудителя сибирской язвы из симбиотической смеси клеток B.anthracis и скользящих бактерий M.xanthus. 1 табл.

1. Способ получения стрептомицинрезистентных вариантов возбудителя сибирской язвы из симбиотической смеси клеток Bacillus anthracis и скользящих бактерий Myxococcus xanthus, включающий посев по стандартной методике клеток В.anthracis на среду, содержащую стрептомицин, подращивание посева при 35-37°С и отбор стрептомицинрезистентных вариантов, отличающийся тем, что после посева по стандартной бактериологической петле биомасс В.anthracis и М.xanthus для их совместного роста на мембранные фильтры, наслоенные на плотную питательную среду без стрептомицина, и после предварительного подращивания смеси микроорганизмов в термостате при 35°С в течение 24 ч осуществляют репликацию (отпечатки) выросших смешанных популяций на фильтрах на среду, содержащую 100 мкг/мл стрептомицина, и инкубируют отпечатки при 35°С в термостате в течение 48 ч с последующим отбором стрептомицинрезистентных колоний на плотную питательную среду, содержащую стрептомицин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отобранные стрептомицинрезистентные колонии для определения уровня резистентности к стрептомицину и свойства стрептомицинзависимости засевают на чашки с питательной средой, содержащей 100, 200, 500, 1000, 2000 мкг/мл стрептомицина, а также на питательную среду, не содержащую стрептомицин, инкубируют посев при 35°С в течение 48-72 ч, о уровне стрептомицинрезистентности вариантов В.anthracis судят по наличию роста популяции микроорганизма на среде с соответствующей концентрацией антибиотика, а о стрептомицинзависимости - по отсутствию роста Str^D варианта на питательной среде без стрептомицина.