СПОСОБ ИНДУКЦИИ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Bacillus anthracis Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/02 C12Q1/04 C12R1/07 C12Q1/02 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам индукции гемолитической активности у возбудителя сибирской язвы.

Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, которое протекает тяжело и скоротечно, нередко заканчивается летально, особенно при висцеральной (генерализованной) форме. Это - сапрозоонозная инфекционная болезнь. Резервуаром возбудителя служит почва, где происходят основные фазы персистенции (переживания и размножения) бацилл. Основной причиной устойчивого неблагополучия по сибирской язве определенных мест и территорий является известное свойство микроорганизма образовывать споры, обладающие высокой жизнеспособностью и продолжительной сохраняемостью в окружающей среде.

На территории Российской Федерации, в странах ближнего и дальнего зарубежья находится значительное количество неблагополучных по сибирской язве регионов (1). В России ежегодно регистрируются случаи заболевания людей и животных сибирской язвой и, соответственно, выявляются очаги с различной эпидемической и эпизоотологической активностью (2). Особую актуальность возбудитель сибирской язвы приобрел после использования спор В. anthracis в качестве орудия биологического терроризма (3).

До настоящего времени не уделялось должного внимания изменчивости сибиреязвенного микроба, что затрудняло его индикацию и идентификацию. Особо остро этот вопрос стоял в контексте возможного изменения генетических свойств В. anthracis в природных условиях.

Большинство исследователей, занимающихся изучением возбудителя сибирской язвы, первостепенное значение в проявлении патогенных свойств сибиреязвенного микроба придают экзотоксину и капсуле. В 1983 г. Mikasell et al. (4) показали, что токсинообразование у В. anthracis детерминировано плазмидой рХ01 большой молекулярной массы, а в 1985 г. двумя группами исследователей Green et al. (5) и Uchida et al. (6) обнаружена и охарактеризована плазмида рХ02 (рТЕ702), обуславливающая капсулообразование возбудителя сибирской язвы.

Некоторые авторы к факторам патогенности бациллы антракса относят способность образовывать протеазу (7), разлагать казеин и желатин (8), вызывать гемолиз эритроцитов (9). Продолжаются исследования, направленные на выяснение механизмов взаимодействия сибиреязвенного микроба с макроорганизмом и определение ключевых звеньев развития заболевания, с целью конкретизации вклада каждого фактора в проявление патогенности.

К настоящему времени установлено, что утрата токсинообразования или капсулы приводит к резкому снижению вирулентности В. anthracis (10).

Помимо токсина и капсулы В. anthracis обладает другими особенностями, оказывающими негативное влияние на макроорганизм. В первую очередь это относится к протеолитической и гемолитической активностям сибиреязвенного микроба.

Общепринято, что отсутствие гемолитических способностей у В. anthracis является наиболее постоянным биохимическим признаком (11, 12, 13, 14, 15 и др.). На этом основании в ряд наиболее специфических методов дифференциации сибиреязвенного микроба некоторые исследователи ставят определение гемолитической активности (16, 17, 18 и др.).

Возбудитель сибирской язвы гемолиза эритроцитов не вызывает или он происходит редко и медленно в отличие от сапрофитных бацилл, которые проявляют быстрый гемолиз (19, 20, 21 и др.). Вокруг колоний близкородственных сапрофитов уже к 10 часам инкубирования выявляется прозрачная зона гемолиза, которая затем значительно увеличивается. Однако описаны сибиреязвенные штаммы, способные гемолизировать эритроциты в течение первых суток культивирования (19, 22, 23).

Противоречивость сведений о гемолитической активности сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов по мнению О.И.Циганковой (23) может быть связана с различиями в методах определения. Так, ею в диссертационной работе было показано, что на проявление гемолитической активности возбудителя сибирской язвы большое влияние оказывает состав питательных сред, время выращивания культуры В. anthracis и срок инкубирования с эритроцитами, вид примененных эритроцитов, способ оценки интенсивности гемолиза и другие факторы (23).

В последнее время T.Read и C.Fraser (24) определили полную последовательность нуклеотидов хромосомы В. anthracis и обнаружили, что некоторые белки, кодируемые хромосомой, могут иметь функции, усиливающие вирулентность, включая гемолизины, фосфолипазы, функции приобретения железа и супероксидисмутазы. По данным других авторов (25) ряд генов В. anthracis кодируют белки, гомологичные гемолизинам, известным как факторы вирулентности различных бактерий. Возбудитель сибирской язвы традиционно считается негемолитическим и при этом отмечается, что гены гемолиза транскрипционно молчащие. Авторы (25) обнаружили, что гены гемолитичности В. anthracis могут быть индуцированы (прототип) в жестких анаэробных условиях, тогда как в аэробных их экспрессия сильно подавлена.

Гены антрализинов, локализованные на хромосоме В. anthracis, экспрессируются (аналог) на ранних стадиях инфекции внутри макрофагов вегетативными бациллами после прорастания спор.

Эти методы (25) являются прототипом и аналогом предложенного нами способа индукции гемолитической активности В. anthracis с помощью M.xanthus.

Таким образом, дополнительные детерминанты вирулентности возбудителя сибирской язвы позволяют выживать штаммам этого микроорганизма внутри организма хозяина, даже лишенным плазмид.

В. anthracis, помимо паразитической фазы развития в организме животного или человека, имеет также сапрофитическую фазу развития, когда возбудитель персистирует в почве, на длительный период становясь сочленом почвенного биоценоза, т.е. сапрозоонозом (26).

Для доказательства сапрофитической природы возбудителя сибирской язвы возможно применение методологии экологического представления о стратегии отбора микроорганизмов. Под стратегией отбора по Роботнову Т.А. (27) необходимо понимать "совокупность приспособлений, обеспечивающих виду возможность обитать совместно с другими организмами и занимать определенное положение в соответствующих биоценозах".

Известно, что патогенные почвенные микроорганизмы (возбудители сапронозов) находятся в симбиотических взаимоотношениях с различными сапрофитами, к которым относится и представитель скользящих бактерий Myxococcus xanthus (28). Этот убиквитарно распространенный микроорганизм подробно охарактеризован в кратком определителе бактерий Берги (29). М. xanthus формирует популяцию, состоящую из клеток с различными физиологическими функциями. При этом миксобактерии никогда не существуют как отдельные клетки, а формируют многоклеточные образования в виде плодовых тел. Клетки популяции миксококков секретируют тяжи слизи - "струи", которые направляют движение совокупностей клеток (фиг.1). Такая колония (плодовое тело) окружает клетки гетерологичных микроорганизмов и заключает их в своеобразные складки в виде "спирали Архимеда", формирующих "карманы" (фиг.2). В них происходит как питание миксококков продуктами метаболизма захваченных клеток, так и сохранение последних.

Миксобактерии чаше всего встречаются в почве, они растут на разлагающемся растительном материале - траве, листьях, коре живых деревьев или помете животных. Есть виды миксобактерий, обитающие в водной среде (29).

Применение методологии экологического понятия о стратегии отбора микроорганизмов (27) для решения центрального вопроса в учении о сапронозах относительно места возбудителей этих инфекций в почвенных биотах позволяет считать вполне возможным совместное обитание В. anthracis и М. xanthus как К-стратегистов.

Моделирование возможного сохранения и распространения B. anthracis в плодовых телах М. xanthus, а также разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами осуществлены нами ранее (30, 31).

Целью настоящего изобретения является разработка нового метода индукции гемолитической активности генов В. anthracis с помощью M. xanthus и дифференциация чистых культур возбудителя сибирской язвы от контаминированных скользящими бактериями.

Поставленная цель достигается тем, что создают условия симбиоза клеток В. anthracis, не проявляющих гемолитической активности, с негемолитическими клетками М. xanthus путем смешивания их и посева симбиотической биомассы бляшкой на поверхность кровяного агара. В качестве контроля на кровяной агар сеют раздельно бляшками эти же культуры В. anthracis и М. xanthus. Посевы инкубируют при 35-37°С в течение 24-48 ч. Фенотипические проявления гемолитических свойств исследуемых культур экспрессируются в виде зоны гемолиза только вокруг смешанной популяции В. anthracis с М. xanthus и отсутствуют в контролях чистых культур В. anthracis и М. xanthus.

Пример 1

Для демонстрации индукции гемолитической активности генов В. anthracis с помощью М. xanthus на поверхности плотной питательной среды агара Хоттингера, содержащего 3-5% дефибринированной крови человека, сеют бляшками раздельно штаммы В. anthracis СТИ и М xanthus №1, не проявляющие гемолитической активности, а также биомассу клеток В. anthracis СТИ, контаминированную клетками М. xanthus №1. В качестве положительного контроля аналогичным способом сеют близкородственную по отношению к В. anthracis культуру сапрофита B. cereus АТСС 6464 и далекородственную - В. subtilis РАС. Посевы инкубируют при 35-37°С в течение 24-48 ч. Вокруг бляшек сапрофитов уже к 10 часам инкубирования выявляется прозрачная зона гемолиза, которая затем значительно увеличивается. Вокруг бляшек В. anthracis и М. xanthus к 48 ч инкубации зона гемолиза не проявляется, а вокруг смешанной популяции В. anthracis, контаминированной клетками М. xanthus, четко проявляется зона гемолиза, как и у сапрофитов (фиг.3).

Такой визуальный эффект, продемонстрированный на фиг.3, позволяет, с одной стороны, засвидетельствовать экспрессию гемолитического (H1у) свойства В. anthracis, индуцированного с помощью М. xanthus, с другой - дифференцировать на кровяном агаре чистые культуры В. anthracis от контаминированных убиквитарным микроорганизмом М. xanthus.

Пример 2

При получении 32 культур В. anthracis из коллекционного центра Ставропольского научно-исследовательского противочумного института у 25% штаммов возбудителя сибирской язвы в паспорте было указано на проявление гемолитического (не типичного для данного вида) свойства.

Посеяв все 32 культуры В. anthracis бляшками на кровяной агар и параллельно на плотную среду Луриа (La), где демонстративно происходит «роение» М. xanthus, было выявлено, что 8 (25%) анализируемых штаммов В. anthracis, именно те, которые проявили гемолитическую активность, загрязнены скользящими (убиквитарно распространенными) микроорганизмами М. xanthus.

На фиг.4 продемонстрированы 6 штаммов В. anthracis, 3 из которых оказались чистыми, а 3 - контаминированных М. xanthus.

1. В. anthracis 81/1 - не проявляющий гемолитического (Н1y^-) свойства.

2. В. anthracis 44/1 СО - не проявляющий гемолитического (Н1y^-) свойства.

3. В. anthracis 2-7 - не проявляющий гемолитического (Н1y^-) свойства.

4. B. anthracis 356/960 (М.х.) - контаминирован М. xanthus (Hly⁺).

5. B. anthracis 560/258 (М.х.) - контаминирован М. xanthus (Hly⁺).

6. B. anthracis 2781 (М.х.) - контаминирован М. xanthus (Hly⁺).

Таким образом, в отличие от методов прототипа и аналога (25), способа индукции гемолитической активности у возбудителя сибирской язвы в предлагаемом нами способе нет необходимости при культивировании В. anthracis создавать жесткие условия анаэробиоза (использовать анаэростаты) или в условиях макроорганизма моделировать инфекционный процесс внутри макрофагов вегетативными бациллами.

Возможность отличать чистые культуры В. anthracis от загрязненных скользящими бактериями по проявлению феномена гемолиза является важным и полезным признаком в дифференциальной диагностике сибирской язвы.

Способ индукции гемолитической активности генов В. anthracis с помощью повсеместно распространенных скользящих бактерий может служить для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем.

Список использованных источников

1. Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Маринин Л.И., Онишенко Г.Г., Степанов А.В. и др. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999 - 224 с.

2. Черкасский Б.Л. Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №2. - С.48-52.

3. Inglesby Т., O.Toole Т., Henderson D. et al. Anthrax as a biological weapon //JAMA. - 2002. - V.287. - P.2236-2256.

4. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph V.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid mediated toxin production in Bacillus anthracis II Infect. Immun. - 1983. - V.39, №1. - Р.371-376.

5. Green B.D., Battisti L., Kochler T.M., Thome C.B., Ivins B.E. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect. Imnun. - 1985. - V.49, №2. - P.291-297.

6. Uchida J., Sekizaki Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsalation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. - 1985. - V.131, N2. - P.363-367.

7. Цуверкалов Д.А., Красов В.М. Протеолитические способности Bac. anthracis. - ЖМЭИ. - 1935. - T.14. B.1. - С.122-128.

8. Генов И. Диагностическая оценка некоторых ускоренных методов дифференциации Bacillus anthracis от других апотогенных спорообразуюших бацилл. - Вет. мед. науки (Болгария). - 1966. - Т.3, №3. - С.247-253.

8. Завирюха А.И., Степанюк О.П. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от ложносибиреязвенных бацилл. В сб.: Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. М., -1978. - С.130-131.

10. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В. и др. Влияние спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность возбудителя сибирской язвы. В сб. материалы юбилейной научн. конф. посвящ. 70-летию НИИ микроб. М.О. РФ, г.Киров. - 1998. - С. 165-166.

11. Шляхов Э.Н. Эпидемиология, диагностика и профилактика сибирской язвы. - Кишинев, Картя. Молдовеняска, 1960, - 116 с.

12. Михин Н.А. Сибирская язва человека и сельскохозяйственных животных. - М., Метгиз, 1942, - 98 с.

13. Вышелесский С. Н. Сибирская язва. - М., 1934, - 102 с.

14. Кузьмин Н.А. Ветеринарная микробиология. - М.-Л., 1950, - 72 с.

15. Коляков Я.Е. Ветеринарная микробиология. - М., 1965, - 68 с.

16. Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М. и др. Сибирская язва. - М., 1970, - 127 с.

17. Коляков Я.Е., Мелихов А. Д. Ветеринария. - 1960. - №3. - С.81-84.

18. Груз Е.В. Изучение и рационализация некоторых лабораторных методов индикации и идентификации Вас. anthracis. Автореф. дис. канд. мед. наук. - Одесса, 1965, - 19 с.

19. Сибирская язва // Под ред. Гинсбурга Н.Н. - М., 1975, - 157 с.

20. Инструкция и методические указания по лабораторной клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. - М., 1983, - 39 c.

21. Методические указания по обнаружению возбудителя сибирской язвы. //Лаб. исследования в ветеринарии. - М., 1986. - с.5-17.

22. Ипатенко Н.Г., Седов В.А., Залепухин B.C. и др. Сибирская язва сельскохозяйственных животных. - М., 1987, - 256 с.

23. Циганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба. Дис. канд. мед. наук. - Саратов, 1993, -179 с.

24. Read Т., Fraser С./ Bacillus anthracis genomic. 5th International Conference on Anthrax // Abstract Book, Nice, France, March 30 - April 3, - 2003 - 0101, p.20.

25. Klichko V., Miller J., Wu A., Popov S. and Alibek K./Anaerobic induction of Bacillus anthracis hemolysins 5th International Conference on Anthrax. // Abcstract Book, Nice, France, March 30 - April 3, 2003. - P.305, Р.58.

26. Литвин В.Ю. Общие закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах //Экология возбудителей сапронозов. - М., 1988. - С.20-34.

27. Работнов Т.А. // Бюл. МОИН. Отд. биол. - 1975. - №30, №2. - С.5-11.

23. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the Mycobacteria // Microbiol. Rev. - 1996. - V.60, N1. - P.70-102.

29. Хоут Дж. Краткий определитель Берги. Скользящие бактерии, - М.: Мир, 1980. - С.49-53.

30. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Моделирование возможного сохранения и распространения Bacillus anthracis во внешней среде // Матер. юбил. конф. посвящ. 70-летию НИИ микробиологии М.О.РФ. - Киров, 1998. - С.356-357.

31. Буланцев А.Л., Липницкий А.В. Разработка способов регистрации симбиотических взаимоотношений патогенных микроорганизмов с сапрофитами // Природно-очаговые ООИ, их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань, 2001. - С.226-228.

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в биотехнологии. Для осуществления способа на поверхность агара Хоттингера, содержащего 3-5% дефибринированной крови человека, сеют симбиотическую смесь культуры B.anthracis с клетками Myxococcus xanthus, которые при раздельном культивировании не проявляют гемолитическую активность. Посевы инкубируют в аэробных условиях до проявления гемолитической активности. Гемолитическую активность определяют по зоне гемолиза вокруг смешанной популяции культуры B.anthracis с клетками Myxococcus xanthus. Использование данного способа позволяет дифференцировать по эффекту гемолиза чистые культуры возбудителя сибирской язвы от контаминированных скользящими бактериями. 4 ил.

Способ индукции гемолитической активности Bacillus anthracis, отличающийся тем, что на поверхность агара Хоттингера, содержащего 3-5% дефибринированной крови человека, сеют симбиотическую смесь культуры B.anthracis с клетками Myxococcus xanthus, не проявляющих гемолитическую активность при раздельном культивировании, посевы инкубируют в аэробных условиях до проявления гемолитической активности, которую определяют по зоне гемолиза вокруг смешанной популяции культуры B.anthracis с М. xanthus.