Способ получения липидов, содержащих @ -линоленовую кислоту Советский патент 1992 года по МПК C12P7/64 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/785 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу физиологически активных веществ.

Известен способ получения лмпидов, содержащих у-линоленовую кислоту, путем выращивания гриба Mucor lusitanicus ИНМИ ВКМ F-306D на среде следующего состава, г/л: глюкоза 30; мочевина 1; К2НР04 1; NaCI 0,5; MgS04 7Н20 0,5; Fe2S04 7Н20 0,01; CaCI2 0,02; ZnS04 7H20 0,01; дрожжевой экстракт 0,5; витамин В6 0,002; биотин 0.02 мг; при 20-30°, рН 4,5-6,5 в течение трех суток при аэрации 1,8 02/л/ч. Получают липиды, содержащие 29-32% у- линоленовой кислоты от суммы жирных кислот. На 100 л использованной глюкозы получают 2,77 гу-линоленовой кислоты. Недостатком этого способа является недостаточно высокое содержание у-линоленовой кислоты в липидах.

Цель изобретения - увеличение содержания у-линоленовой кислоты в липидах.

Указанная цель достигается тем, что гриб Mucor lusitanicus BKM F-306D выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза 30-60 г; мочевина 1-2; K2HPO i 1-2; NaCI 05+0,01; MgS04 7H20 0,5+0,01; FeS04 -7Н20 0,01-0,02; CaCl2 0,02+0.001; ZnS04 -7H20 0,01+0,001; MnO 0.01±0,001; дрожжевой экстракт 0,3-0,5; солодовый экстракт 0,05-0,1; витамин Be 0,002; биотин 0,02 мг, при 20-30°, интенсивности аэрации 1,6-1,8 02/л/ч, рН среды перед посевом 6,3- 6,8. Выращивание проводят в течение 66- 72 ч, Концентрацию азота в среде на протяжении выращивания поддерживают в определенном интервале - 0,25-0,7 г/л. Для этого азот добавляют дробно - при посеве 50% мочевины, в конце первых суток 25- 50%, в конце вторых суток- остальное. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием. Липиды экстрагируют из влажной биомассы смесью хлороформ-метанол-вода 1 2:0,8 Жирнокислотный соXJ

СЛ

го

став липидов определяют методом газожидкостной хроматографии метиловых эфи- ров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом, В результате получают липиды, содержащие 40-45% у -лино- леновой кислоты от суммы жирных кислот. Пример 1. Культуру выращивают в течение 72 часов в колбах на 2 л, содержащих 300 мл среды при 28°С на качалке. Состав среды, г/л:

Глюкоза30

Мочевина1

К2НР041

NaCI0,5

MgS04 7Н200,5

FeS04 7Н200,01

ZnS04 7Н200,01 .

,02

MnO0,01

Дрожжевой экстракт 0,3 Солодовый экстракт 0,05 Витамин Be0,002

Биотин0,02 мг

Мочевину при посеве добавляют в количестве 0,5 г, через 24 ч - 0,5 г на 1 л среды.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 106 кл/мл. Споровый материал выращивают на пшеничных отрубях.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, экстрагируют липиды смесью хлороформ-метанол-вода 1:2:0,8, Полученные липиды содержат 40% у-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот. Выход биомассы на 100 г глюкозы - 36, липидов - 10,5 г, сумма жирных кислот - 7,93, из них у-линоленовая кислота -3,21 г.

В табл. 1 представлен состав жирных кислот липидов гриба Mucor lusitanicus HH- MVt.

Пример 2. Культуру выращивают в течение 66 ч в 2-литровых колбах, содержащих 300 мл среды при 28°С и интенсивности аэрации 1,8 г Ог /л /ч. Состав среды, г/л: Глюкоза60

Мочевина2

КаНРСм2

NaCI0,5

MgSOo 7Н200,5

FeS04 7Н200,02

ZnS04 7Н200,01

Дрожжевой экстракт 0,5 Солодовый экстракт 0,1 Витамин Be0,002

Биотин0,02 мг

Мочевину при посеве добавляют в количестве 1 г, через 27 ч - 0,5 г, через 42 ч - 0,5

г. Биомассу отделяют от культуральной жидкости, липиды экстрагируют как в примере 1. Полученные липиды содержат 45% у-линоленовой кислоты от суммы жирных

кислот. Выход биомассы на 100 г использованной глюкозы - 36,6 г, липидов - 11,2 г, жирных кислот - 8,4 г, у-линоленовой кислоты - 3,8 г.

В табл, 2 представлен состав жирных

кислот липидов гриба Mucor lusitanicus НИМИ

Используя предложенный метод, получают жирные кислоты, содержащие 40- 45% у-линоленовой кислоты, при этом на

100 г использованного источника углерода Получают до 3,80 г у-линоленовой кислоты, в то время как в предложенном ранее способе получают липиды, содержащие 29- 32% у-линоленовой кислоты от суммы

жирных кислот, и на 100 г использованной глюкозы выход у-линоленовой кислоты составляют 2,77 г.

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа получения у-линоленовой кислоты по сравнению с ранее предложенным является повышение выхода у-линоленовой кислоты на 100 г использованного источника углерода в 1,4 раза за счет повышения содержания у -линоленоаой кислоты в липидах, Повышение содержания в липидах у-линоленовой кислоты удешевляет получение ее чистого препарата, также повышает ценность липидов как основы для получения лекарственных препаратов. Увеличение выхода целевого продукта достигается путем изменения режима азотного питания продуцента. Время ферментации сокращается до 66 ч.

40

Формула изобретения

Способ получения липидов, содержащих у-линоленовую кислоту, путем выращивания гриба Mucor lusitanicus BKM F-306D

на питательной среде, содержащей мочевину 1-2 г/л, глюкозу - 30-60 г/л, минеральные соли, микроэлементы, дрожжевой экстракт и витамины, при 20-30°С, рН 4,5- 6,5, аэрации 1,6-1,8 02 л/ч в течение 2,6-3,0

сут., отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания у-линоленовой кислоты в липидах, процесс ведут на питательной среде, дополнительно содержащей солодовый экстракт в количестве 0,05-0,1

г/л, в мочевину подают дробно по схеме: 50% при посеве, 25-50% в конце первых суток, а при наличии остатка его вводят в конце вторых суток.

Т а-6 лица 1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу физиологически активных веществ, в частности липидов, содержащих у-линоленовую кислоту. Целью изобретения является увеличение содержания у -линоленовой кислоты в липидах. Это достигается путем выращивания гриба Mucor lusitanicus ВКМР306-Д при глубинном культивировании в условиях непрерывной аэрации на питательной среде, содержащей углеводородный источник углерода и неорганический источник азота, среда дополнительно содержит солодовый экстракт в количестве 0,05-0,1 г/л, источник азота подают дробно по схеме: 50% при посеве, 25-50% в конце первых суток, остальное в конце вторых суток. В течение трех суток на 100 г использованного источника углерода синтезируется до 3,8 г у-линоленовой кислоты. 2 табл. сл

Таблица 2