Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и онкологии, и может быть использовано для уточняющей диагностики ревматоидного артрита, системой красной волчанки и онкологических заболеваний.
Аналог изобретения не выявлен.
Проблема диагностики аутоиммунных заболеваний разрабатывается учеными многих стран. Вопросы диагностики, особенно ранней, представляют большие трудности. В это время основные синдромы часто нетипичны и нередко принимаются за проявления других болезней и наоборот, а основные лабораторные признаки (изменение клинических, биохимических, иммунологических показателей) часто не являются патогномоничными. По данным Насоновой В.Н., Астапенко М. Г. , ревматоидный фактор определяется в ранних стадиях заболевания с длительностью до 1 года 20-30%, а у больных с длительностью заболевания до 6 месяцев не определяется. Антинуклеарные антитела определяются у 30%. Даже по данным В.А.Дуляпина в биопсированной жидкости синовиальной оболочки обнаруживают в части случаев лишь явления неспецифического синовита.
В настоящее время существует метод определения РФ (ревматоидного фактора) на клеточном уровне, так называемый тест ревматоидной розетки, который оказывается положительным у 60-70% больных, даже у серонегативных. Однако неспецифичность этого теста не позволяет придавать ему самостоятельного значения.
В связи с этим целью изобретения является разработка диагностического теста, способствующего раннему распознаванию ревматоидного артрита и системой красной волчанки.
Тест осуществляется следующим образом. Обследуют доноров и больных, находящихся на лечении в стационаре. У обследуемого берут кровь из вены (3 мл) в пробирку с гепарином, на 1 мл крови 25 ед. гепарина. Кровь разводят раствором Хенкса в соотношении 1: 1. На дно сухой пробирки наливают 3 мл градиента плотности (1,077 г/мл). Наслаивают разбавленную кровь на градиент плотности, не допуская перемешивания сред. Центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин.
После центрифугирования пипеткой убирают надосадочную жидкость и собирают верхнее кольцо, состоящее из лимфоцитов, в сухую пробирку. Нижний слой плазмы, содержащий гранулоциты, собирают в другую пробирку. Добавляют раствор Хенкса до 5 мл, ресуспендируют, отмывают при 1500 об/мин 10 мин. Убирают надосадочную жидкость. Добавляют раствор Хенкса, чтобы получилась суспензия лимфоцитов в объеме 1 мл, гранулоцитов - 0,7 мл. Ресуспендируют. Подсчитывают клетки в камере Горяева и доводят до нужной концентрации (лимфоциты - 4,5х109/л, гранулоциты - 3,0 х 109/л). Переносят лимфоциты в бакпечатку и инкубируют 1 ч при температуре 37oС в термостате. Гранулоциты переносят на покровное стекло, помещенное в какую-нибудь посуду, и инкубируют 1 ч в термостате при температуре 37oС. После инкубирования убирают надосадочную жидкость с гранулоцитов и добавляют к гранулоцитам лимфоциты. Инкубируют 1 ч при температуре 37oС в термостате. Затем добавляют 1 каплю глютарового альдегида 3%-ного и выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре. Убирают надосадочную жидкость. Мазки высушивают. Окрашивают по Маю-Грюнвальду. Высушивают при комнатной температуре. С помощью микроскопа определяют количество свободно лежащих лимфоцитов и розеткообразующих. Для повышения точности результатов подсчет ведут на 300 клеток в трех полях зрения.
При разработке способа было обследовано 100 доноров. Определялись показатели взаимодействующих клеток при различной исходной концентрации, различном температурном режиме и времени инкубации. Определена контрольная группа показателей, которую в дальнейшем приняли за норму (см.табл. 1). Для достоверности показателей параллельно обследовались группы больных с острыми и хроническими заболеваниями. В процессе анализа данных было установлено, что показатели 1 лимфоцит + 1 гранулоцит (в дальнейшем ЛСГ-1) отражают преимущественно воспалительные процессы, 1 лимфоцит + 2 гранулоцита (в дальнейшем ЛСГ-2) - иммунодефицитные состояния, показатели 1 лимфоцит + 3,4,5 гранулоцитов (в дальнейшем ЛСГ-3, ЛСГ-4, ЛСГ-5) отражают аутоиммунные состояния.
В настоящее время доказана аутоиммунная природа ревматоидного артрита и системной красной волчанки.
Обследовано 14 больных с ревматоидным артритом, 10 больных с системой красной волчанкой.
Группу больных с ревматоидным артритом 70% составили лица с длительностью до 1 года, из них у 46% ревматоидный фактор не определялся.
Предлагаемым способом у 100% больных определялось наличие ЛСГ-4 (см. табл.2).
В дальнейшем диагноз был подтвержден комплексом клинико-лабораторных и инструментальных исследований.
Группу больных системной красной волчанкой составили 40% больные с длительностью заболевания до двух лет. У 40% LE клетки не обнаружены, Ревматоидный фактор определялся лишь у 20% больных.
Предлагаемым способом у всех больных определялся показатель ЛСГ-5 (см. табл.3).
Таким образом, предлагаемый тест имеет следующие достоинства.
1. Повышает точность диагностики, так как за 4 ч позволяет врачу определиться с клиническим диагнозом - ЛСГ-4, ЛСГ-5 выявляются в 100% случаев.
2. Предлагаемый метод не нуждается в условиях стерильности, дорогостоящих и дефицитных материалах (используется всего 1 реактив).
3. Реакция проста в исполнении.
Нами были обследованы больные с онкологической патологией в ранней стадии заболевания. Полученные данные свидетельствуют о том, что уже в ранней стадии заболевания идет угнетение гранулоцитосвязывающих лимфоцитов по сравнению с донорами в несколько раз (см.табл.4), что имеет важное диагностическое значение. Иммунологические сдвиги можно выявить на ранней стадии заболевания, когда другие лабораторные показатели еще не реагируют.
Использование: в медицине для уточняющей диагностики ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ) и онкологических заболеваний. Сущность изобретения: производят забор венозной крови пациента, выделяют лимфоциты и гранулоциты с последующим построением цитолейкограммы и диагностируют РА при выявлении четверных розеток, содержащих 1 лимфоцит и 4 гранулоцита, СКВ - при выявлении пятерных розеток, содержащих 1 лимфоцит и 5 гранулоцитов и онкологическое заболевание - при обнаружении исчезновения тройных розеток и уменьшения, по сравнению с нормой, в 5 раз двойных и в 4 раза одинарных розеток. Тест для уточняющей диагностики позволяет получить достоверные результаты в течение 4-х ч, не требует особой стерильности, дефицитных реактивов, дорогостоящих приборов и прост в исполнении. 5 табл.
Тест для уточняющей диагностики РА - ревматоидного артрита, СКВ - системной красной волчанки и онкологического заболевания путем забора венозной крови пациента, выделения лимфоцитов и гранулоцитов с последующим построением цитолейкограммы и диагностированием РА при выявлении четверных розеток, содержащих 1 лимфоцит и четыре гранулоцита, СКВ - при выявлении пятерных розеток, содержащих 1 лимфоцит и 5 гранулоцитов и онкологического заболевания - при обнаружении исчезновения тройных розеток и уменьшения, по сравнению с нормой, в 5 раз двойных и в 4 раза одинарных розеток.
