СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно, к способам выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма.

Лизабельность сибиреязвенным бактериофагам является одним из трех основных тестов, позволяющих идентифицировать сибиреязвенные культуры, выделенные из объектов внешней среды, а также из материала от больных животных и людей. Особую ценность приобретает этот тест при выделении штаммов сибиреязвенного микроба, атипичных по капсулообразованию и вирулентности.

Принципиальная технологическая схема получения фага включает добавление в бульонную культуру специального производственного фага, размножение при 37^oC в течение суток, фильтрацию и проверку на чистоту, стерильность, безвредность и активность. /К. Д. Пяткин, Ю. С.Кривошеин, Микробиология, М., "Медицина", 1980, с. 108/.

Наиболее близким по существу к заявляемому способу является способ изготовления фага Гамма. /Н.Г.Игнатенко и др. Сибирская язва сельскохозяйственных животных, М., "Агропромиздат", 1987, с. 174-175/.

По этому способу культуру сибиреязвенного штамма высевают в дрожжевой бульон с pH 7.2-7.4 и инкубируют при 37^oC в течение 18-20 ч, затем эту культуру высевают в дрожжевой агар и выдерживают в термостате при 37^oC в течение 24 ч, выращенную культуру смывают физиологическим раствором и доводят до концентрации 1.5-2 млрд. микробных клеток (м.к.) в 1 мл по оптическому стандарту и засевают в мясопептонный бульон из расчета на 100 мл среды 1 мл культуры и добавляют 1 мл маточного фага. Раствор перемешивают и ставят в термостат при температуре 37^oC на 24 ч. Затем среду фильтруют через стерилизующие фильтровальные пластины СФ.

Полученный фаг проверяют на чистоту, активность и специфичность. Активность фага должна быть не менее 10^-7.

Недостатком прототипа является многоступенчатость и длительность выращивания бактериофага (74-80 ч). Кроме того, большое количество манипуляций с культурой штамма при переносе из дрожжевой среды в дрожжевой агар, приготовление взвеси под стандарт оптической мутности, засев в мясопептонный бульон увеличивает возможность калтаминации посторонней микрофлорой.

Целью изобретения является упрощение и сокращение времени получения бактериофага при сохранении его качества по активности и специфичности.

Поставленная цель достигается тем, что бульонную культуру получают засевом спор сибиреязвенного штамма в питательный бульон на основе бульона Хоттингера с добавлением 2.0-2.5 г/л экстракта дрожжей и 0.30-0.33 г/л кальция хлористого, инкубацию проводят в течение 5-6 ч при встряхивании при 37^oC с pH 7.2-7.4 с последующим внесением маточного бактериофага в полученную культуру, затем бактериофаг размножают при 37^oC в течение 24 ч и фильтруют.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование в качестве посевного материала сибиреязвенного штамма для выращивания бактериофага спор обеспечивает исключение операций выращивания 2-х предварительных генераций культуры и соответственно, сокращение времени процесса и снижение контаминации посторонней микрофлорой.

При использовании для засева культуры спор с определенной концентрацией она может храниться и применяться в течение нескольких лет с переконтролем концентрации спор не чаще 1 раза в год.

Засев высокопитательной среды спорами и выращивание в течение 5-6 ч в режиме встряхивания позволяет получить более однородную по возрасту молодую культуру в достаточной для получения высоких титров фага концентрации.

Уменьшение количества манипуляций с культурой снижает затраты времени с 68 до 30 ч на производство фага, затрачиваемые объемы питательных сред и возможность контаминации посторонней микрофлорой и обеспечивает стабильное получение бактериофага с достаточно высокой степенью активности и специфичности.

В табл. 1 (см. в конце описания) представлены сравнительные данные по затратам времени на технологические операции по прототипу и заявляемому способу.

Способ осуществляется следующим образом. Готовится питательная среда следующего состава: 1 л бульона Хоттингера pH 7.2-7.4, 2-2.5 г дрожжевого экстракта (Sigma), 3 мл стерильного 10% раствора кальция хлористого, после чего pH устанавливается в пределах 7.4±0.1 при помощи 1 л раствора едкого натра. После этого среда разливается в колбы и стерилизуется 30 мин при давлении пара 1 атм.

Питательная среда засевается взвесью спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55 из расчета 6-10 млн спор на 1 мл питательной среды. Посевы помещаются на встряхиватель при 37^oC, при 40-60 качаниях в минуту на 5-6 ч. После этого в бульонную культуру вносим препарат маточного фага Гамма из расчета 1-2 мл на 100 мл бульонной культуры. Посевы помещаются в термостат при 37^oC на 24 ч. Препарат фильтруется на установке "Millipara" с применением стерилизующих фильтров. Определяется специфичность и активность (титр по Аппельману).

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Готовили питательный раствор следующего состава: 1 л бульона Хоттингера pH 7.2, 2 г дрожжевого экстракта (Sigma) 0.30 г кальция хлористого, доводили pH среды до 7.4 1н раствором едкого натра, разливали по 100 мл в 500-миллиметровые колбы и стерилизовали при давлении 1 атм 30 мин. Питательную среду засевали спорами сибиреязвенного вакцинного штамма 55 из расчета 1 млрд спор на 100 мл питательной среды. Помещали на 5 ч при 37^oC на шутель при 60 встряхиваниях в мин.

Вносили маточную культуру бактериофага Гамма с титром 6•10⁹ из расчета 2 мл на 100 мл бульонной культуры. Поместили на 19 ч при 37^oC. После фильтрации через мембранные фильтры "Millipara" титр по Аппельману составил 4•10⁹.

Пример 2. Готовили питательный бульон следующего состава: 1 л бульона Хоттингера с pH 7.2, 2.5 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0.31 г кальция хлористого, pH доводили 1 н раствором едкого натра до 7.45. Среду разливали в колбы по 100 мл, стерилизовали при давлении в 1 атм, 30 мин.

Среду засевали спорами сибиреязвенного вакцинного штамма 55 из расчета 600 млн. спор на 100 мл среды. Посевы помещали при 37^oC на шутель при 50 встряхиваниях в 1 мин. Через 6 ч вносили культуру маточного бактериофага Гамма с титром 6•10⁷ 2 мл на 100 мл бульонной культуры и помещали в обычный термостат при 37^oC. Через 24 ч фильтровали через мембранные фильтры "Millipara". Титр составил 6•10⁹.

Пример 3. Готовили питательную среду следующего состава: 1 л бульона Хоттингера с pH 7.3, 2.2 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0.33 г кальция хлористого. Доводили pH среды до 7.4 1 н. раствором едкого натра. Разливали по 50 мл в 200-миллиметровые колбы, стерилизовали при давлении пара 1 атм, 30 мин.

Питательную среду засевали 800 млн спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55 на 100 мл среды. Помещали на шутель при 37^oC 40 встряхиваниях в 1 мин.

Через 5 ч 30 мин вносили 2 мл маточной культуры сибиреязвенного бактериофага Гамма с титром 6•10⁹ и помещали на 18 ч в обычный термостат при 37^oC, после чего фильтровали через мембранные фильтры "Millipara". Титр бактериофага составил 8•10¹⁰.

Полученные серии бактериофага были проверены на специфичность действия на 50 культурах близкородственных спорообразующих сапрофитов рода Bacillus (лизировались 3 штамма Bac. megtherium и 2 штамма Bac. Subtilis) и 50 штаммах сибиреязвенного микроба, все из которых лизировались полученными сериями бактериофага.

Как показали экспериментальные испытания, снижение менее 5 ч времени выращивания бульонной культуры не обеспечивает ее необходимой концентрации для размножения бактериофага, увеличение этого времени нецелесообразно, так как в заявленных пределах времени при заявленном составе питательного бульона и режиме встряхивания достигается необходимая концентрация бактериальных клеток. Увеличение дозы посевного материала бульонной культуры свыше 1 млрд. спор на 100 мл среды и маточного бактериофага свыше 2 мл на 100 мл бульонной культуры не увеличивает титр получаемого препарата бактериофага, снижение доз посевного материала менее 500 млн. спор и менее 1 мл фага - ведет к снижению титра получаемого препарата.

Концентрация добавляемого в бульон Хоттингера экстракта дрожжей и кальция хлористого являются оптимальными для выращивания культуры, получения бактериофага и сохранения его функциональной активности.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в микробиологии позволит организовать серийный выпуск высококачественных бактериофагов для идентификации сибиреязвенных культур, выделяемых от больных и животных и объектов внешней среды, что обеспечивает своевременность постановки диагноза и проведения соответствующих противоэпидемических мероприятий.

Изобретение предназначено для выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма. Бульонную культуру получают засевом спор сибиреязвенного штамма в питательный бульон на основе бульона Хоттингера с добавлением 2,0 - 2,5 г/л экстракта дрожжей и 0,30 - 0,33 г/л кальция хлористого. Инкубацию проводят в течение 5 - 6 ч при встряхивании при 37^oC с рН 7,2 - 7,4. Далее вносят маточный бактериофаг в культуру. Бактериофаг размножают при 37^oC в течение 24 ч и фильтруют. Изобретение упрощает и сокращает время получения бактериофага при сохранении его качества по активности и специфичности. 1 табл.

Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма, включающий инкубацию бульонной культуры сибиреязвенного штамма в питательном бульоне при 37^oC с рН 7,2-7,4 с добавлением в нее маточного бактериофага, размножение бактериофага при 37^oC в течение 24 ч, фильтрацию, отличающийся тем, что бульонную культуру получают засевом спор сибиреязвенного штамма в питательный бульон на основе бульона Хоттингера с добавлением 2,0-2,5 г/л экстракта дрожжей и 0,30-0,33 г/л кальция хлористого, инкубацию проводят в течение 5-6 ч при встряхивании с последующим внесением маточного бактериофага в полученную культуру.