СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ РИСКА НАРУШЕНИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНА/ПЛОДА И РОЖДЕНИЯ РЕБЕНКА С РАЗЛИЧНЫМИ ОТКЛОНЕНИЯМИ Российский патент 2004 года по МПК A61B10/00 G01N33/53 

К настоящему времени накоплен обширный материал, свидетельствующий об участии иммунной системы в регуляции течения беременности и развитии эмбриона. Так, по мнению Gleicher (1994), без учета состояния иммунной системы женщины невозможно дать реальную оценку состояния ее репродуктивной функции. М.В. Федорова и соавт. (1997) особо отмечают, что иммунологические нарушения являются наиболее ранними признаками неблагоприятных изменений в организме под влиянием неблагополучной внешней среды. В то же время конкретные механизмы участия иммунной системы в процессах гестации и закладки органов и тканей эмбриона и плода во многом остаются неясными.

В норме иммунная система человека продуцирует антитела не только к чужеродным, но и практически ко всем собственным антигенам, т.е. аутоантитела (а-АТ), которые участвуют практически во всех процессах, происходящих в организме. В условиях нормы сывороточное содержание аутоантител поддерживается в определенных границах. А патологическое повышение или снижение их уровней может вести к различным патологическим состояниям. Изменения продукции а-АТ различной специфичности могут быть следствием влияния как различных внешних, так и внутренних факторов (экологические факторы, стрессы, инфекции, эндокринно-метаболические нарушения и др.). Причем эти изменения могут касаться и тех а-АТ, поддержание физиологических концентраций которых критически важно для физиологического течения беременности и нормального эмбриогенеза. Известно, что антифосфолипидные антитела могут нарушать обмен мембранных фосфолипидов и повреждать сосуды плаценты во время гестации (Серова О.Ф. Прегравидарная подготовка женщин с невынашиванием беременности (патогенетическое обоснование, критерии эффективности). Дисс. докт. мед. наук., М., 2000).

По данным Полетаева А.Б. и Селифановой О.П. повышение уровней материнских аутоантител к белку ткани мозга S100 приводит к различной патологии патологии со стороны нервной системы у плода (Poletaev А.В., Selifanova О.Р., Transfer of elevated anti-S100 autoimmunity from mother to their offsprings in rats. Life Sci., 1994. V. 54, № 18, 1377-1381).

Что касается генетически обусловленных пороков развития, то частота их встречаемости не превышает 3-6% от всех врожденных пороков. Остальные 94-97% врожденной патологии обусловлены различными изменениями в организме матери.

Изложенное выше послужило основанием для создания тест-систем для определения содержания а-АТ к различным белковым фракциям, изменения сывороточного уровня, аффинности которых коррелируют с нарушениями развития эмбриона/плода.

Аналогом заявленного изобретения является способ скринингового обследования женщин детородного возраста для прогноза развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка с помощью тест-системы ELI-P (патент РФ №2107913, МПК 7 G 01 N, 27 марта 1998 г.). В основе данного метода лежит определение сывороточного уровня а-АТ к ОБМ, белкам S100, АСВР-14/18 и МР-65. По наибольшей степени отклонения одного или нескольких определяемых показателей судят о прогнозе развития эмбриона/плода и рождения здорового либо аномального ребенка в соответствии с приведенной таблицей прогноза.

В то же время индивидуальные изменения иммунореактивности к данным отдельным белкам могут не отражать глобальных изменений в системе гуморального аутоиммунитета в организме женщины. Поэтому рассмотренный способ является недостаточно точным.

В отличие от известного способа скринингового обследования, предлагаемый нами способ, заключающийся в определении содержания а-АТ к различным фракциям белковых антигенов позволяет существенно повысить точность прогнозирования развития эмбриона/плода.

Целью заявляемого способа является повышение надежности прогноза нормального или аномального развития эмбриона и плода на основе оценки сывороточных уровней а-АТ к фракциям белковых антигенов (до беременности или во время беременности), возможности прогнозирования течения гестационного процесса, оценка эффективности проводимой терапии и оптимизация прегравидарной подготовки.

Поставленные цели достигаются путем реализации существенных признаков предлагаемого способа, а именно: проведение иммуноферментного анализа для определения уровней а-АТ с направленностью к фракциям белковых антигенов со сравнением интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые образцы сыворотки с лунками, содержащими образцы референс-сыворотки, с последующем определением соотношения между уровнями (выраженность дисперсии в уровнях определяемых антител относительно дисперсии их средних показателей в популяции) данных а-АТ. Определение содержания исследуемых а-АТ может быть проведено также другими способами, например, с помощью оптического биосенсора.

Для проведения предлагаемого анализа требуется 0,01-0,02 мл сыворотки крови женщины (например, из подушечки пальца).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ ФРАКЦИЙ, КОТОРЫЕ МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

1. Получение фракции негистоновых анионных белков хроматина (АСВР-С).

Из свежего мозга крупного рогатого скота любым способом получают фракцию клеточных ядер. Полученные ядра гомогенизируют, центрифугируют и для дальнейшей работы отбирают осадок, который отмывают, гомогенизируют с добавлением 2 М мочевины и 0.1% тритона Х-100. Полученный препарат центрифугируют, собирают супернатант, диализуют и наносят на колонку с анионообменником. Затем проводят ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl 0.3-0.7 М NaCl. Полученный материал используется в работе.

2. Получение фракции мембранных белков мозга (МР-С).

Из свежего мозга крупного рогатого скота любым методом выделяют фракцию клеточных мембран. Полученные мембраны гомогенизируют, центрифугируют, собирают осадок, который отмывают, гомогенизируют с добавлением 0.1% тритона Х-100 и 2 М мочевиной. После центрифугирования супернатант наносят на колонку анионообменника. Затем проводят ступенчатую элюцию белков, используя градиенты NaCl на том же буфере. Отбирают фракцию, элюируемую в диапазоне 0.15-0.3 М NaCl.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовят растворы полученных фракций белковых антигенов на карбонатном буфере. Приготовленные растворы вносят в отдельные лунки планшета. Накрытые крышками планшеты инкубируют ночь при 2-4°С.

2. Удаляют из лунок растворы белков и заливают в них блокирующий буфер (например, 0.5% раствор желатина на 0.15 М NaCl). Инкубируют 1 час при 37°С.

3. Отмывают планшеты отмывочным буфером (0.15 М NaCl с 0.05% твин-20).

4. Внесение тестируемых сывороток:

а) готовят разведения сывороток 1:200 на отмывочном буфере;

б) вносят разведенные сыворотки в лунки;

в) планшеты инкубируют ночь при 2-4°С.

5. Отмывают планшеты отмывочным буфером.

6. Проявление реакции:

а) исходный раствор конъюгата пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека разводят в необходимое число раз (в зависимости от его активности) отмывочным буфером;

б) раствор конъюгата вносят во все лунки планшета;

в) планшеты инкубируют 60-90 мин при 37°С, либо 12-16 час при 2-4°С; коньюгат удаляют, а планшеты отмывают отмывочным буфером;

г) сразу после этого в лунки вносят раствор субстрата (например, 0.01% тетраметилбензидина с 0.01% перекиси водорода на 0.05 М цитрат-фосфатном буфере рН 4.5-5 в случае применения пероксидазных конъюгатов). Инкубируют планшеты в темноте 10-15 мин при комнатной температуре.

9. По достижении оптимального уровня окрашивания (через 10-15 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М серной кислоты.

10. Интенсивность окрашивания оценивают с помощью ИФА-ридера любой модели.

11. Обработка полученных данных

По полученным значениям оптической плотности содержимого лунок, рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с фракциями белковых антигенов по отношению к эталону (в процентах). В качестве эталона использовали образец сыворотки со средними значениями иммунореактивности с используемыми в работе системами антигенов.

12. Интерпретация полученных данных

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов не выходит за пределы от -15% до +40% по отношению к реакции референс-сыворотки (эталона), данную сыворотку относят к классификационной группе К1 (норма).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов выходит за пределы группы К1, но составляет не менее -25% и не более +65% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе К2 (слабые отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов выходит за пределы групп К1 и К2, но составляет не менее -45% и не более +100% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе КЗ (умеренные отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов выходит за пределы групп K1, K2 и К3, но составляет не менее -65% и не более +150% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе К4 (значительные отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов выходит за пределы группы К4 по отрицательным значениям ниже -65%, а по положительным значениям находится в диапазоне от +150% до +200% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к классификационной группе К5 (резкие отклонения).

В случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из фракций белковых антигенов выходит за пределы групп K1, K2, К3, К4 и К5, данную сыворотку относят к классификационной группе К6 (очень резкие, эксквизитные отклонения).

Эмпирические данные, полученные при анализе результатов родов женщин, предварительно обследовавшихся с применением данного метода, позволили выявить следующие закономерности:

В целом, риск неблагоприятного течения беременности и рождения детей с различными отклонениями повышался с увеличением классификационной группы (от К1 до К6). Однако внутри каждой группы часто наблюдались достоверные различия в прогнозе в зависимости от снижения или повышения уровней а-АТ.

Изменения уровня а-АТ к АСВР-С и МР-С могут вести к остановкам развития эмбриона и плода, бесплодию, различным изменениям со стороны внутренних органов новорожденных (врожденные пороки сердца, гипоплазии внутренних органов, гидронефроз почек и др.), различным анатомическим уродствам.

Предложенный метод может применяться как независимо от других, так и в комплексе с другими известными методами обследования, в результате чего возможен более точный прогноз течения и исхода беременности.

Наиболее эффективно применение данного метода в динамике для более эффективного мониторинга течения беременности и контроля эффективности проводимой терапии. Если после проведенной терапии как в период предгравидарной подготовки, так и во время беременности наблюдается тенденция к нормализации показателей предложенного теста, можно сделать вывод о ее эффективности.

При проведении данного анализа возможно определение а-АТ к одной или нескольким фракциям белковых антигенов, а также в комплексе с определением содержания а-АТ к различным очищенным антигенам, например, к основному белку миелина (ОБМ), белку S100. Наиболее оптимально, когда диагностическая система состоит из 3-5 тест-антигенов (фракции белковых антигенов, возможно, в сочетании с очищенными антигенами).

Если при проведении анализа с использованием фракций белковых антигенов или в комплексе с различными очищенными антигенами наблюдаются нескоординированные или разнонаправленные изменения иммунореактивности по отношению к разным тест-антигенам (в качестве тест-антигена может выступать фракция белковых антигенов), то у пациента, как правило, наблюдаются различные эндокринно-метаболические расстройства. Повышение содержания исследуемых а-АТ, как правило, свидетельствует о наличии инфекционного, воспалительного или аллергического процесса. Снижение исследуемых показателей обычно указывает на наличие активной вирусной или вирусоподобной инфекции; также наблюдается при длительных контактах с различными вредными веществами при длительном приеме некоторых фармпрепаратов.

Гипореактивность исследуемых эффективно коррегируется с помощью иммуномодулирующих средств в 82% случаев. Гиперреактивность данных а-АТ поддается коррегирующей терапии значительно хуже (р<0,01) и, как видно из таблиц прогноза, достоверно чаще приводит к рождению детей с пороками развития.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Обследуемая Е.И., 22 года. Детей нет. Первая беременность 7 нед. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности и результаты родов: Беременность протекала без осложнений. Срочные роды, родился мальчик в удовлетворительном состоянии, рост 51 см, вес 3700 г, балльность по шкале Апгар - 9.

Пример 2

Обследуемая А.А., 22 года. Детей нет. Первая беременность 6 нед. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности и результаты родов: Беременность протекала без осложнений. Срочные роды, родился мальчик в удовлетворительном состоянии, рост 52 см, вес 3 400 г, по шкале Апгар - 9 баллов.

Пример 3

Обследуемая М.А., 35 лет. Четвертая беременность, 12 нед. Двое детей, здоровы. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности и результаты родов: Беременность осложнилась водянкой. Срочные роды, признаки гипотрофии и внутриутробного инфицирования, девочка рост 50 см, вес 2000 г, по шкале Апгар - 6-7 баллов.

Пример 4

Обследуемая В.В., 28 лет. Вторая беременность, 6 нед. Есть ребенок, 6 лет, здоров. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности: прекратившаяся в развитии беременность на сроке 9-10 нед.

Пример 5

Обследуемая М.Е., 32 года. Третья беременность, 11 нед. Детей нет. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности, роды и катамнез. Беременность осложнилась нефропатией I степени. Срочные роды, девочка рост 50 см, вес 3100 г, по шкале Апгар - 7-8 баллов. Неврологическая симптоматика. В возрасте 1 года диагностирован детский церебральный паралич.

Пример 6

Обследуемая А.Л., 37 лет. Вторая беременность 8 нед., в анамнезе выкидыш. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста:

Течение беременности. Результаты родов: Беременность осложнилась нефропатией II степени. Фетоплацентарная недостаточность. Преждевременные роды на сроке 32 нед. Вес 1200 г. Признаки гипотрофии, морфофункциональной незрелости, внутриутробного инфицирования.

Пример 7

Обследуемая Т.С., 34 года. Один ребенок 2 лет с диагнозом: задержка моторного развития. Планирует беременность.

Результаты диагностического теста ELI-P:

Течение беременности и результаты родов: Беременность осложнилась нефропатией III степени. Преждевременные искусственные роды на сроке 21 нед.; множественные пороки развития, несовместимые с жизнью.

Пример 8

Обследуемая К.И., 30 лет. Первая беременность. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста на 7 нед.:

Течение беременности, роды и катамнез. Беременность осложнилась нефропатией II степени. Срочные роды, мальчик рост 51 см, вес 3200 г. Диагносцирован врожденный порок - атрезия слухового прохода.

Пример 9

Обследуемая Н.А., 28 лет. Первая беременность. Наследственность не отягощена.

Результаты диагностического теста на 8 нед.:

Течение беременности, роды и катамнез. Осложнений беременности не наблюдалось.

Срочные роды, мальчик рост 52 см, вес 3350 г. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Катамнестическое наблюдение за ребенком в течение 1,5 лет не выявило какой-либо патологии.

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ И СОЦИАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ МЕТОДА

Применение описанного метода для прогнозирования течения беременности и ее исхода может значительно снизить процент женщин с осложненным течением беременности за счет своевременного выявления групп риска и проведения адекватных лечебно-профилактических мероприятий, а также снизить процент рождения детей с пороками развития. Выполнение исследования может производится на основе иммуноферментного анализа сыворотки крови и безопасно для женщины и будущего ребенка.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста до или во время беременности. Используют тест-систему для ИФА, содержащую планшеты с сорбированными фракциями негистоновых анионных белков хроматина ткани мозга (ФАСВР-С) и/или мембранных белков мозга (ФМР-С). Определяют иммунореактивность сывороточных аутоантител к ФАСВР-С и ФМР-С. Если интенсивность реакции (ИР) исследуемой сыворотки (ИС) с любой из указанных фракций белковых антигенов не выходит за пределы: -15: +40% по отношению к реакции сыворотки, взятой за эталон, то ИС относят к группе К1 - нормы; если ИР выходит за пределы К1, но составляет не менее - 25% и не более 65% - относят к группе К2 - слабых отклонений; если выходит за пределы К1 и К2, но составляет не менее - 45% и не более 100% - относят к группе К3 - умеренных отклонений; если выходит за пределы К1, К2 и К3, но составляет не менее - 65% и не более 150% - относят к группе К4 - значительных отклонений; если выходит за пределы К4, по отрицательным значениям ниже - 65%, а по положительным значениям находится в диапазоне от 150 до 200% - относят к группе К5 - резких отклонений, а если выходит за пределы К1, К2, К3, К4 и К5 - относят к группе К6 - очень резких, эксквизитных отклонений, и прогнозируют риск неблагоприятного течения беременности и нарушений развития эмбриона/плода с увеличением группы от К1 до К6. Способ позволяет повысить достоверность данного вида прогнозов. 2 нез. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ прогнозирования течения беременности и определения степени риска нарушений развития эмбриона/плода у женщин детородного возраста до или во время беременности, включающий забор крови, получение сыворотки и определение иммунореактивности сывороточных аутоантител организма женщины, отличающийся тем, что иммунореактивность сывороточных аутоантител определяют к фракциям негистоновых анионных белков хроматина и мембранных белков мозга, при этом если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любой из указанных фракций белковых антигенов не выходит за пределы -15: +40% по отношению к реакции сыворотки, взятой за эталон, то исследуемую сыворотку относят к классификационной группе К1 - норме; если интенсивность реакции выходит за пределы группы К1, но составляет не менее - 25% и не более 65% - относят к группе К2 - слабым отклонениям; если выходит за пределы групп К1 и К2, но составляет не менее -45% и не более 100% - относят к группе К3 - умеренным отклонениям; если выходит за пределы групп К1, К2 и К3, но составляет не менее -65% и не более 150% - относят к группе К4 - значительным отклонениям; если выходит за пределы группы К4, по отрицательным значениям ниже -65%, а по положительным значениям находится в диапазоне от 150 до 200% - относят к группе К5 - резким отклонениям, а если выходит за пределы групп К1, К2, К3, К4 и К5 - относят к группе К6 - очень резким, эксквизитным отклонениям и прогнозируют риск неблагоприятного течения беременности и нарушений развития эмбриона/плода с увеличением классификационной группы от К1 до К6.2. Тест-система для определения иммунореактивности сывороточных аутоантител, содержащая стандартные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа, отмывочный буфер, сыворотку - этанол, раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами к иммуноглобулинам IgG человека, раствор субстрата и раствор 0,2-0,4 М серной кислоты для остановки реакции, отличающаяся тем, что планшеты содержат сорбированные фракции негистоновых анионных белков хроматина ткани мозга (АСВР-С) и/или мембранных белков мозга (МР-С).