СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТРОМБИНА III Российский патент 2002 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностике и контроле лечения различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, хирургических, гематологических и других, при которых в крови изменяется активность антитромбина III. Этот показатель характеризует изменение активности важнейшего естественного антикоагулянта и степень тяжести заболевания. Снижение активности антитромбина III имеет место при ДВС-синдроме, последний же представляет собой наиболее частый вид патологии гемостаза. Поэтому поиск удобных способов определения активности антитромбина III в плазме крови больных является актуальной задачей. Для этой цели используют амидолитические методы, основанные на реакции взаимодействия этих белков с хромогенными пептидными субстратами, в результате которого происходит гидролиз субстрата и образуется окрашенное вещество - pNa (п-нитроанилин). Известно несколько синтетических пептидных субстратов, специфичных для одного из компонентов системы гемостаза - тромбина, на основе которого определяют активность антитромбина III [1, 2].

В качестве ближайшего аналога рассмотрим метод определения данной активности с помощью трипептида HD-Phe-Pip-Arg-pNa. HCl [3]. Этот субстрат (выпускаемый фирмой "Behring", Германия) получил самое широкое распространение и применяется для определения активности антитромбина III в плазме крови по остаточной активности тромбина, взятого в избытке, после образования комплекса тромбин-антитромбин III.

Определение проводится следующим способом. К 0,05 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина (концентрация исходного раствора 10 мг/мл, активности 27,5 ед/мл), инкубируют 5 мин при 37^oС, добавляют 0,10 мл 3 мМ раствора субстрата и либо определяют прирост оптической плотности за 1 мин спектрофотометрически при 405 нм, либо после двухминутной инкубации пробы при 37^oС реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты, после чего определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Активность Антитромбина III выражают в % и определяют по формуле:
%АТIII=(А_{контроль}-А_{образец})xF_L,
где: А_{контроль} - оптическая плотность контрольного образца, А_{образец} - оптическая плотность исследуемого образца, F_L - коэффициент, зависящий от температуры измеряемых раствором, который при 37^oС составляет 688 [4].

Синтез пептида HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl осуществляют методами классической пептидной химии. Он представляет собой трудоемкий многостадийный процесс, включающий (исходя из свободных аминокислот в зависимости от схемы) 10-12 стадий [5].

Задача. Разработать способ определения активности антитромбина III с помощью хромогенного субстрата, легко доступного для синтеза. Задачу решают путем использования в качестве хромогенного пептидного субстрата вещество z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr, где z - бензилоксикарбонил, Aia-аланин, Arg-аргинин, pNa-п-нитроанилин, НВr-бромистоводородная кислота.

Способ получения z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr значительно проще и включает всего 7 стадий, причем две из них представляют собой ферментативные реакции, протекающие практически с количественным выходом [6].

Способ в общем виде
Метод определения антитромбина III повторяет существующий метод и отличается только использованием в качестве субстрата тромбина вещества, отвечающего химической формуле z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.

К 0,05 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина, инкубируют 5 мин при 37^oС, добавляют 0,10 мкл 3 мМ раствора субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr, инкубируют 2 минуты при 37^oС, останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при 405 нм. Активность антитромбина III выражают в процентах к норме и вычисляют по формуле:
,
где: АТIIIстандарт. - известное содержание АТIII в стандартной плазме; Астанд. - оптическая плотность стандартной плазмы; Аобразец - оптическая плотность исследуемого образца плазмы.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (контроль к примеру 2). Определение активности антитромбина III в пуле плазмы 10 здоровых доноров с помощью набора реактивов фирмы Behring (Германия).

К 0,2 мл исследуемой плазмы крови добавляют 1 мл тромбина, инкубируют 5 мин при 37^oС, добавляют 0,10 мкл 3 мМ раствора субстрата HD-Phe-Pip-Arg-pNa. HCl, инкубируют 2 мин при 37^oС, останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 20%-ной уксусной кислоты. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,12 ΔА/мин и была принята за 100%.

Пример 2. Определение активности антитромбина III в пуле плазмы 10 здоровых доноров с помощью предложенного субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.

Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,118 ΔА/мин, что соответствует 98,3% антитромбина III.

Пример 3. Определение активности антитромбина III в крови больных с ДВС-синдромом (диагноз инсульт и вторичный гнойный менингит) с помощью субстрата HD-Phe-Pip-Arg-pNa.HCl фирмы Behring (Германия).

Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,070 ΔА/мин, что соответствует 58,3% антитромбина III.

Пример 4. Определение активности антитромбина III в крови больных с ДВС-синдромом (диагноз инсульт и вторичный гнойный менингит) с помощью субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa.HBr.

Определение проводят как в примере 1, но используют раствор субстрата z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr. Оптическая плотность раствора при 405 нм составила 0,067 ΔА/мин, что соответствует 55,5% антитромбина III.

Таким образом, из примеров 1 и 2 следует, что заявленный способ определения этих ферментов по чувствительности не уступает методу, изложенному в ближайшем аналоге. А примеры 3 и 4 свидетельствуют о том, что способ с применением пептида z-Ala-Ala-Arg-pNa. HBr достаточно чувствителен и позволяет достоверно определить активность антитромбина III при более низком его содержании в крови больных.

Литература
1. Lottenberg R., Hall J.A., Fenton J.W. et.at., Thromb. Res., 1982, 28, 3, р. 313-32.

2. Sender S.A., Fenton J.W., Clin. Chen., 1986, 32, 6, р. 934-7.

3. Antithrombin III., Behring E, Berichrom, 1990.

4. Band N.U., Mattler L.E., Haemost., 1988, 7, 2-3, р. 98-104.

5. Sushil K. Sharma, Francis J. Castelino, Trombosis Research, 57, 1990, 127-138.

6. Voyushina T.L., Terent'eva E.Yu., Stepanov V.M., Biomed. Biochim. Acta, 50 1991, 209-212.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Способ обеспечивает простоту исследования активности антитромбина III. Проводят исследование плазмы крови путем добавления к ней хромогенных пептидных субстратов с последующим определением степени их гидролиза, при этом в качестве хромогенного субстрата используют вещество, имеющее химическую структуру z-Ala-Ala-Arg-pNa.R, где R - кислота.

Способ определения антитромбина III в плазме крови путем добавления к ней хромогенных пептидных субстратов с последующим определением степени их гидролиза, отличающийся тем, что в качестве хромогенного субстрата используют вещество, имеющее химическую структуру z-Ala-Ala-Arg-pNa•R, где R - кислота.