Способ получения эндо- @ -1,3- и эндо- @ -1,6-глюканаз Советский патент 1984 года по МПК C12N9/42 

Изобретение относится к способу выделения ферментов, а именно к спос бу одновременного получения -1,3- и р-1,6-эндоглюканаз, которые могут ис пользоваться в качестве биохимически реактивов (для установления структуры -углеводсодержащих биополимеров), в медицинской практике (для разрушения клеточных стенок-патогенных микроорганизмов) , в промьшленкости (для получения глюкозы из водорослей или их отходов). Известен способ выделения эндо- 1,3-глюканазы из кристаллических сте бельков моллюска Chlamys ablidis, включающий стадию хроматографии на акрилексе П-30 Г 1JОднако с помощью этого способа может быть выделена только эндо- 1 ,3-гл1оканаза, а не обе глюканазы. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому зффекту к предлагаемому является способ получе ния эндо-/1-1,3-и зндo-/ -1,6-глюканаз, включающий гомогенизацию исходного сырья в буферном растворе, центрифугирование и хроматографическое разделение двух ферментов на сефадексе Г-100 2. Способ заключается в выделении двух глюканаз из Bacillus circulaus WL-12, При 3TOM/i-1,3- и/з-1,6-глюканазные активности полностью разделяются. Элюаты двух хроматографических разделений объединяют и получают 1-1 ,3-глюканазу (выход) 43% с очисткой в 3 раза и PI-1,6-глюканазу с очисткой в 29 раз (выход 80%). Однако известный способ является многостадийным, так как требует выращивания культуры-продуцента и посл дующей обработки сырья в течение длительного времени. Продолжительность всего процесса составляет окол 8 сут. Кроме того,для выделения ферменто Требуется большое количество различных реактивов. Целью изобретения является упроще ние процесса. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения эндо1 -1,3- и эндо-/ь-1,6-глюканаз, включа ющему гомогенизацию исходного сырья в буферном растворе, центрифугирова ние с последующим хроматографическим разделением ферментов, гомогенизации подворглют кристадтлические стебельки промыслового моллюска Patinopecten yessoensis, а хроматографическое разделение ферментов проводят на карбоксиметилцеллюлозе с элюцией линейным градиентом NaCI от О до 1М в буферном растворе. Способ вьщеления эндо-/э-1,3-и зндо- -1,6-глюканаз заключается в том, что кристаллические стебельки моллюсков гомогенизируют с 0,05 М ацетатным буфером (рН-5,2), центрифугируют и полученньй супернатант подвергают ионообменной хроматографии на колонке с карбоксиметилцеллголозой. На чертеже представлен профиль элюции глюканазных активностей с колонки КМ-целлюлозы. На Чертеже приняты следующие обозначения: 1 - белок 2 -d-,3 -/3-1,6-, 4 - -1,3-глюканазные активности; 5 - линейный градиент NaC1; фракции 90-110 - препарат эндо- -1,6-глюканазь1-, фракции 160220 - препарат эндо- -1,3-глюканазы. Поглощение при 280 нм регистрируют постоянно с помощью Увикорда-П (фирма ЛКБ, Швеция). Активность глюканаз оценивают методом НельсонаСомоджи по нарастанию восстанавливающей способности с применением в качестве субстратов ламинарина (/3 1,3-глюкан), пустулана (р-1,6-глюкан) , амилопектина (i-l, А-глюкан) и растворимой КМ-целлюлозы (/3-1,4 глюкан) . Использование кристаллических стебельков промыслового моллюска морского гребешка Patinopecten yessoensis позволяет упростить процедуру получения глюканаз, а также утилизировать отходы, образующиеся при разделке моллюсков. . Пример. 20 г кристаллических стебельков морского гребешка гомогенизируют на мешалке 4 ч со 100 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 5,2). Полученный вязкий раствор центрифугируют 15 мин при 10000 х, осадок отбрасывают, а супернатант (120 мл) наносят на колонку с карбоксиметилцеллюлозой (2,6 х 15 см), предварительно уравновешенную указанным буфером. Несорбированный белок отмывают тем же.буфером, а глюканазные активности элюируют линейно возрастающей концентрацией хлористого натрия (от О до 1М) в 1 л буфера.

В ходе ионообменной хроматографии происходит разделение эндо-/Э-1,3- и эндо- э-1,6-глюканазных активностей. Получают 29,8 мг эндо-/3-1,3-глюканазы с выходом 49% и отчисткой в А А раза, и 29,7 мг эндо- -1,6-глюканазы с выходом по активности 22% и очисткой в 19 раз. Препарат эндо-у&-1,3глюканазы не содержит других глюканазньпс активностей, а препарат эндо6-1,6-глюканазы не содержит -1,4глюканазную активность, но имеет примесь и -1,3-глюканазы (18%) и ,4-глюканазы (13%), которые могут быть в случае необходимости отделены гель-хроматографией.

Предлагаемый способ по сравнению с известньм имеет следующие преимущества.

Время выделения ферментов составляет менее двух суток, а число стади уменьшено до трех. Использование иа последней стадии выделения ферментов ионообменной хройатографии (вместо гель-фильтрации) позволяет обрабатывать весь материал сразу, без делени на порции, что существенно упрощает технологический процесс.

При получении эндо- -1,3-глюканазы предлагаемым способом степень очистки увеличивается в 14 раз.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-/31,3- И ЭНДО- -1,6-ГЛЮКАНАЗ, включающий гомогенизацию исходного съфья в буферном растворе, центрифугирование с последующим хроматографическим разделением ферментов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, гомогенизации подвергают кристаллические стебельки промыслового моллюска Patinopecten yessoensis, а хроматографическое разделение ферментов проводят на карбоксиметилцеллюлозе с элюцией линейным градиентом NaCI от О до 1М в буферном растворе. СП с о со О5 4 Ы ранцич