Способ получения протаминов Советский патент 1985 года по МПК A61K38/16 A61K35/60 

| Изобретение относится к биохимии может быть использовано для получения протаминов из гонад рыб. Известен способ получения прота минов из молок рыб, заключающийся в зкстракции сырья водным раствором неорганических кислот, сорбции прот мина из полученного экстракта при рН 6-to ионитом в NH форме, представляющем собой сополимер акрилони рита и дивинилбензола с содержанием последнего 15-40% и десорбции целевого продукта раствором неор.ганичес Кой кислоты 1 , Однако известный способ не обеспечивает получения полностью обессо ленных белков. Известен также способ получения (Протаминов, заключающийся в том, что гонады рыб очищают от жира и со единительной ткани и гомогенизируют Б растворе Рингера (0,65% NaCl, 0,014% КС1, 0,012% CaClj, . КаНСОз, 0,001% NaHjPO), фильтруют через хлопковую ткань и центрифугируют. Осадок промывают раствором Рингера и повторно гомогенизируют в 2 М NaCl. К солевому раствору добавляют насыщенный раствор сульфа та меди для осаждения ДНК. К раствору добавляют 1/8 М пикрата натрия. Осадок пикрата протамина отделяют центрифугированием и растворяют в 67%-ном водном ацетоне, Протамин-сульфат осаждают этиловым спиртом после добавления нескольких капель 2 М серной кислоты. Для очистки от пикрат-иона протамин-сульфат переосаждают несколько раз из водно го раствора спиртом 2 , Такой способ позволяет получить протамины в нативном виде, однако он трудоемок, требуется значительно время для получения протаминов; для получения пикрата натрия исполь зуется взрывоопасна:Я пикриновая кис лота. Кроме того, необходимость онистки от избытка пикрата натрия приводит к большому расходу спирта. Целью изобретения является сокра щение времени и повьшение чистоты целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения протаминов, включающему очистку гонад рыб от жира и соединительной ткани, гомогенизацию, фильтрование, центрифугирование, промывку осадка раствором Рингера и повторную гомогенизацию с последующим выделением целевого пр одукта, повторную гомогенизацию проводят в натрий-ацетатном буфере рН 4,6, содержащем 1,4 М натрия хлорида, полученный гомогенизат обрабатывают ультразвуком в течение 2-3 мин и выделяют целевой продукт сорбцией на катионообменнике. Пример 1. Гонады Acipenser Aellatus очищают от жира и соединительной ткани, 5 г полученного материала гомогенизируют в 30 мл раствора Рингеда и фильтруют через хлоп- ковую ткань. Осадок промывают раствором Рингера и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 10 мин.. 100мг полученного нуклеопротамина (сухой вес) повторно гомогенизируют в 10 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера рН 4,6, содержащего 1,4 М NaCl. Полученный гомогенизат подвергают действию ультразвука на приборе УЗДН-1 с силой тока 0,4 А и рабочей частоте 22 кГц 2 мин и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин. Нлдосадочную жидкость наносят на колонку с катионообменником Амберлит ЦГ-50 (1,5x5,0 см), уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером рН 4,6, содержащим 1,4 М NaCl. Колонку промывают последовательно исходным буфером, 0,2 н.уксусной кислотой и водой, Протамины злюируют 0,1 н. НС1 и рН быстро доводят до 5-6 с помощью анионообменника Амберлит 1РА-400 в ОН форме. Все операции проводят при . Полученные протамины высущивают лиофильйо. Аминокислотный состав вьщеленного протамина следующий, мольн.%: Arg51,8 His9,4 Lys14,1 Glx0,9 Thr2,4 Ser6,1 Pro0,9 Gly , 4,7 Ala6,6 Len2,8 Получилось 26 МГ хлоргидрата протамина. Пример 2, Осуществляют то же, что в примере 1, при этсм время озвучивания равняется 1 мин, сила тока 0,6 А. Получилось 20 мг хлоргидрата протамина. Пример 3, Осуществляют то же, что в примере 1, при этом время озвучивания равняется 3 ,мин, сила тока 0,8 А. Получилось 26 мг хлоргидрата протамина. Пример 4. Осуществляют то же, что в примере 1, при этом время озвучивания равняется 5 мин, сила тока 0,8 А. Получилось 26 мг хлоргидрата протамина. Таким образом, при осуществлении предлагаемого способа упрощается методика выделения протаминов, что позволяет исключить такие трудоемк операции как осаждение ДНК.сульфатом, меди осаждение протаминов пикра том натрия, разрушение пикрата прот мина водным ацетоном, многократное 00. 4 переосаждение протаминов из водного раствора спиртом; полностью исключается использование взрывоопасной пикриновой кислоты и спирта. Кроме того, сокращается время получения протаминов с 5-6 до 1,82,0 дней. Избирательное сорбирование на катионообменнике протаминов позволяет полностью освободиться от балластньЬс белков и продуктов их деструкции и значительно повысить чистоту протаминов. Отсутствие операции переосаждения протаминов ведет к интенсификации процесса.

СПОШВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТАМИНОВ, включающий очистку гонад рыб от жира з . и соединительной ткани, гомогенизацию, фильтрование, центрифугирование, промывку осадка раствором Рингера и повторную гомогенизацию с последующим вьщелением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени получения и повышения чистоты целевого продукта, повторную гомогенизацию проводят в натрий-ацетатном буфере рН 4,6, содержащем 1,4 М натрия хлорида, полученный гомогенизат обрабатывают ультразвуком в течение 2-3 мин и выделяют целевой продукт сорбцией на катионообменнике. (О с