АЛКАЛОИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07D471/12 C07D487/12 A61K31/645 A61K31/435 

В данном изобретении описаны новые алкалоиды из Mappia foetida, их терапевтическое применение и содержащие их препараты.

Алколоиды настоящего изобретения имеют следующую формулу (I):

фоетидин 1 : R = H, фоетидин 2 : R = OCH₃.

При обработке кислотами или щелочами, или гидролитическими ферментами фоетидины 1 и 2 количественно высвобождают соответственно : либо известный алкалоид камптотецин, молекула которого была широко испытана фармакологически и клинически, как таковая или в виде производных, в онкологии и при лечении некоторых вирусных заболеваний, либо 9 - метоксикамптотецин, полезный при тех же показаниях.

Камптотецин формулы II

был впервые выделен вместе с другими соединениями из Camptoteca acuminata (Nyssaceae) и из других растений, среди которых Mappia foetida (Olinaceae), хотя последний изучался в течение длительного времени, при дальнейшем химическом скрининге были неожиданно обнаружены новые алкалоиды, которые даже при обработке сырых растительных экстрактов давали камптотецин.

Среди соединений, из которых был выделен камптотецин, особенно важен фоетидин 1, так как он содержится в растениях в больших количествах. Исследование его структуры при помощи спектрального анализа и химической деградации привело к идентификации соединения, для которого характерно наличие звена спермидина, дважды этерифицированного кумаровой кислотой, которая, в свою очередь, этерифицирована открытым звеном камптотецина (см. формулу I). Это соединение содержится во всех частях растения, но особенно в семенах и корнях, в количествах, колеблющихся от 0,1 до 0,5%. Его преимущество по сравнению с комптотецином состоит в том, что он легко растворим в воде при слегка кислом pH; камптотецин, наоборот, полностью нерастворим в воде и во всех биологически приемлемых носителях, поэтому были предприняты интенсивные усилия, чтобы устранить этот недостаток и получить полусинтетический препарат.

Фоетидин 1 получен экстракцией различных частей растений низкомолекулярными алифатическими спиртами или кетонами, отдельно или в смеси с водой при комнатной температуре; экстракты концентрировали при низкой температуре, предпочтительно ниже 25^oC в вакууме; органический растворитель удаляли и водный концентрат экстрагировали хлорированными растворителями для извлечения слабощелочных алкалоидов, среди которых камптотецин, 9-метоксикамптотецин и маппицины; в дальнейшем водную фазу экстрагировали н-бутанолом или не смешиваемыми с водой спиртами, которые затем концентрировали досуха при низкой температуре в вакууме. Осадок из бутанольных экстрактов очищали на силикагеле или сходных с ним адсорбентах; для элюирования использовали смеси хлорированных растворителей, предпочтительно хлористый метилен, и алифатические спирты, предпочтительно метанол или этанол. Использовали, главным образом, смеси в соотношении от 4:1 до 1:1. Фракции, содержащие описываемые в изобретении алкалоиды, объединяли, концентрировали досуха и осадок далее очищали при помощи препаративной ЖХВР, с применением, например, колонки Li Chroprep RP8, элюировали градиентом метанол/вода, начиная с соотношения метанол/вода 1:1, до чистого метанола. Фракции, содержащие алкалоиды, концентрировали при низкой температуре в вакууме, водный концентрат подвергали сушке при температуре ниже 0^oC (вымораживанием). Чистые алкалоиды получали при помощи кристаллизации.

Полученные вещества подвергали биологической оценке на линиях опухолевых клеток человека (яичника, грудной железы, толстой кишки, легких, устойчивых или не устойчивых к другим противоопухолевым соединениями, и т.п.) и на некоторых штаммах вирусов. В действительности, известно, что камптотецин, или, скорее, некоторые из его производных обладают цитотоксической активностью, связанной с ингибированием ДНК топоизомера I и II.

Например, цитотоксичность для клеточной линии карциномы прямой кишки составляет около 25 нМ. Антивирусная активность фоетидина 1, даже с учетом различной устойчивости штаммов, проявляется при концентрациях, варьирующихся от 1 до 100 нг/мл. Фоетидин 2, отличающийся от фоетидина 1 наличием метоксила в 9-положении, действует аналогичным образом. Доказано, что вирус герпеса, цитомегаловирус и ВИЧ чувствительны к алкалоидам изобретения.

Соединения данного изобретения могут быть включены во все виды фармацевтических препаратов, но прежде всего они могут легко вводиться парэнтерально в водных растворах при pH, совместимых с pH крови, не вызывая преципитации или несовместимости. В препаратах могут быть использованы все стандартные фармацевтические наполнители. Дозировки этих новых алкалоидов могут варьироваться от 0,5 до 200 мг на дозу и терапевтический цикл. По предварительным данным, эффективными являются дозы около 50 мг/м².

Приведенные ниже примеры далее иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Пример 1. Получение фоетидина 1 из семян Mappia foetida.

5 кг мелко измельченных семян Mappia foetida трижды экстрагировали 50 л ацетона при помешивании при комнатной температуре; объединенные ацетоновые экстракты концентрировали в вакууме до 10 л; концентрат разбавляли 10 л 1%-ного раствора лимонной кислоты; нерастворимые вещества фильтровали и отбрасывали, тогда как водно-ацетоновую фазу противоточно экстрагировали хлористым метиленом для выделения алкалоидов (камптотецина, метоксикамптотецина и так далее); водно-ацетоновую фазу концентрировали до воды, и концентрат экстрагировали н-бутанолом после нейтрализации до pH 7,5 для удаления фоетидинов 1 и 2. Н-бутанольный раствор концентрировали и осадок высушивали, получая около 200 г бутанольной фракции, которую фракционировали следующим образом: 30 г бутанольной фракции хроматографировали на силикагеле /500 г/ с последующим элюированием колонки сначала смесью хлористый метилен/метанол в соотношении 4:1, затем смесью тех же растворителей в соотношении 7:3. Продукт, содержащийся во фракции, элюированной смесью 7:3 очищали на колонке Li Chroprep RP8 и элюировали градиентом метанол/вода. Фракции, содержащие фоетидины 1 и 2, объединяли и концентрировали досуха в вакууме при температуре ниже 30^oC, осадок кристаллизовали из смеси ацетон/гексан. Получали 5,1 г фоетидина 1, имеющего следующие характеристики: т. пл. 157 - 158^oC; [α]_D = -37,9 (c = 0,31, MeOH). ¹Н-ЯМР - спектр / 300 МГц, DMCO-d₆/, 8,60 /1H, с, H-7/, 8,19 /1H, т, J = 5,2, H-10/, 8,15 /1H, д, J = 8,6, H-12/, 8,05 /1H, д, J = 8,6, H-9/, 8,04 /1H, т, J = 5,2, H-19/, 7,80 /1H, т, J = 7,8, H-11/, 7,65 /1H, т, J = 7,8, H-10/, 7,35 /2H, д, J = 8,6, H-3 + H-5/, 7,34 /2H, д, J = 8,6, H-24 + H-28/, 7,29 /1H, д, J = 15,8, H-7/, 7,28 /1H, д, J = 15,8, H-22/, 6,76 /4H, д, J = 8,6, H-6 + H-25 + H-27/, 6,36 /1H, д, J = 15,8, H-8/, 6,35 /1H, д, J = -15,8, H-21/, 5,58, 5,41 /2H, система AB, J = 10,6, H-17/, 5,18 /2H, с, H-5/, 3,21 /2H, м, H-11/, 3,13 /2H, м, H-18/, 2,84 /4H, шт. J = 7,2, H-13 + H-15/, 2,02 /1H, м, H-19A/, 1,96 /3H, с, CH₃CO/, 1,90 /1H, м, H-19B/, 1,74 /2H, м, H-12/, 1,55 /2H, м, H-16/, 1,46 /2H, м, H-17/, 0,84 /3H, т, J = 7,2, H-18/.

¹³С-ЯМР-спектр: /78,1 МГц, DMCO-d₆/: 175,23 /с, C-21/, 170,81 /с, CH₃CO/, 166,27 /с, C-9'/, 165,83 /с, C-20'/, 161,43 /с, C-16a/, 159,40 /с, C-1'/, 159,14 /с, C-15/, 153,50 /с, C-2/, 148,36 /с, C-13/, 143,56 /с, C-3/, 139,37 /д, C-7/, 139,06 /д, C-22'/, 131,74 /д, C-7/, 130,58 /д, C-11/, 130,33 /с, C-6/, 129,63 /с, C-3' + C-5'/, 129,56 /д, C-24' + C-28'/, 129,40 /д, C-12/, 128,83 /д, C-9/, 128,23 /с, C-8/, 127,78 /д, C-10/, 126,23 /д, C-4'/, 126,13 /с, C-23'/, 123,42 /с, C-16/, 119,01 /д, C-8'/, 118,68 /д, C-21'/, 116,18 /д, C-2' + C-6' + C-26' + C-27'/, 100,68 /д, C-14/, 80,28 /д, C-20/, 59,87 /т, C-17/, 50,45 /т, C-5/, 47,23 /т, C-13'/, 45,36 /т, C-15'/, 38,41 /т, C-18/, 36,36 /т, C-11'/, 33,40 /т, C-19/, 26,99 /т, C-12'/, 26,87 /т, C-17'/, 24,04 /т, C-16'/, 21,22 /к, CH₃CO/, 9,29 /к, C-18/.

Фоетидин 2 /1,2 г./ был получен из маточного раствора после кристаллизации фоетидина 1 путем очистки хроматографией с обращенной фазой с применением того же самого элюента.

Фоетидин 2 имеет следующие характеристики: т. пл. 172 - 174^oC. [α]_d -44,6 (c = 0,35, метанол). ЯМР - спектр перекрывался со спектром фоетидина 1, за исключением сигнала - OCH₃ на ароматическом кольце при 3,2 млн. дол.

Пример 2. Приготовление высушенных вымораживанием флаконов, содержащих фоетидин 1.

5 г фоетидина 1 растворяли в 500 мл дистиллированной воды, содержащей 1,2 г лимонной кислоты, раствор фильтровали, стерилизовали и разливали в стерильной комнате в 100 флаконов, которые быстро замораживали и подвергали сушке при ниже 0^oC.

Данное изобретение касается новых алкалоидов из Mappia foetida (фоетидинов 1 и 2, приведенных в тексте опмсания), обладающих противораковыми и антивирусными свойствами. Эти алкалоиды, растворимые в воде, присутствуют во всех частях растения и являются предшественниками камптотцина и 9-метоксикамптотецина, которые, как известно, являются алкалоидами, обладающими фармакодинамическими свойствами, но не растворимы в воде. Именно способность новых соединений растворяться в воде делает их особенно пригодными для парэнтерального введения при лечении больных, что позволяет избежать применения токсических наполнителей или неприемлемых химических производных. Фоетидины получают экстракцией различных частей растений Mappia foetida алифатическими низкомолекулярными спиртами или кетонами. 3 с. и 5 з.п. ф-лы.

1. Алкалоидные соединения общей формулы I

в которой R представляет собой водород или метокси. 2. Соединение по п. 1, которое представляет фоетидин 1, в котором R представляет водород. 3. Соединение по п. 1, которое представляет фоетидин 2, в котором R представляет метокси. 4. Способ получения соединений I по п.1, отличающийся тем, что осуществляют:
а) экстракцию различных частей растений Mappia foetida алифатическими низкомодекулярными спиртами или кетонами, в отдельности или в смеси с водой, при комнатной температуре;
в) концентрирование экстрактов при температуре ниже 25^oС в вакууме;
с) экстракцию водно-ацетонового концентрата, полученного путем частичного удаления органического растворителя, хлорированными растворителями для извлечения слабо щелочных алкалоидов;
d) экстракции водной фазы н-бутанолом;
е) очистку бутанольных экстрактов, полученных концентрированием при низкой температуре в вакууме, с помощью хроматографии на силикагеле, с использованием смесей хлорированных растворителей и алифатических спиртов в качестве растворителей;
f) концентрирование досуха фракций, содержащих алкалоиды, и очистку остатка с помощью препаративной ЖХВР, элюирование градиентом метанол/вода, начиная с соотношения метанол/вода = 1 : 1 до чистого метанола;
g) сушку вымораживанием полученного водного экстракта и кристаллизацию чистого фоетидина 1;
h) хроматографическую очистку маточного раствора от кристаллизации с обращенной фазой с использованием того же элюента, как на стадии f) с получением фоетидина 2. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что на стадии е) применяют хлористый метилен и метанол или этанол соответственно в качестве хлорированных растворителей и алифатических спиртов в соотношении в смеси от 4 : 1 до 1 : 1. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что на стадии f) используют колонку "LiChroprep RP8". 7. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой и противовирусной активностью, содержащая в качестве активного ингредиента одно из соединений по пп.1 - 3 в эффективном количестве. 8. Соединение по любому из пп.1 - 3, обладающее противовирусным и противоопухолевым действием.