ПРОИЗВОДНЫЕ КАМПТОТЕЦИНА С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК C07D491/22 A61K31/4745 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к новым производным камптотецина, обладающим противоопухолевой активностью, способам их получения, применению их в качестве противоопухолевых лекарственных средств и содержащим их фармацевтическим композициям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Камптотецин является алкалоидом, выделенным из Camptotheca acuminate (Камптотека остроконечная) (Nyssaceae), впервые описанным Wall и Wani в 1966 году (J. Am. Chem. Soc. 1966, 3888-3890). Хотя камптотецин обладает широким спектром противоопухолевой активности, особенно в отношении рака толстой кишки и других солидных опухолей и лейкозов, он не используется в терапии из-за своей высокой токсичности, которая, в частности, проявляется в форме геморрагического цистита, гастроинтестинальной токсичности и миелосупрессии.

Для того чтобы получить соединения с низкой токсичностью и высокой растворимостью, были синтезированы несколько аналогов камптотецина. В настоящее время в клинической практике используются два лекарственных средства, а именно CPT-11 и топотекан. Другие производные, такие как белотекан, рубитекан, экзатекан, гиматекан, пегамотекан, луртотекан, каренитецин, афелетекан, гомокамптотецин, дифломотекан и многие другие, проходят клинические испытания. Соединение CPT-11 является высокорастворимым пролекарством для 10-гидрокси-7-этилкамптотецина (более известного как SN-38), одобренного для лечения многих солидных и асцитных опухолей (опухолей толстой и прямой кишки, кожи, желудка, легких, шейки матки, яичников и неходжкинской лимфомы).

Топотекан является соединением, растворимым в физиологическом растворе, активным в отношении опухолей легкого, желудка, печени, яичников, молочной железы, простаты, пищевода, прямой кишки, сарком мягких тканей, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов. Однако топотекан обладает значительными побочными эффектами, такими как нейтропения и тромбоцитопения.

Луртотекан является более растворимым соединением, обладающим активностью в отношении опухолей шеи, яичников, груди, толстой и прямой кишки и легочной микроцитомы. Однако луртотекан также обладает гемической токсичностью.

Рубитекан является пролекарством, предназначенным для перорального применения, эффективным в отношении опухолей поджелудочной железы, яичников и молочной железы.

Камптотецин и его аналоги так же, как и все ингибиторы топоизомеразы I, эффективны в отношении опухолей, резистентных к обычным лекарственным средствам, включая ингибиторы топоизомеразы II; поддерживают высокий уровень топоизомеразы в течение всего клеточного цикла; не провоцируют множественную лекарственную устойчивость (определяемую белками Pgо или MRP) или детоксикационный метаболизм, опосредованный ферментом.

Теперь исследования сосредоточены на новых ингибиторах топоизомеразы I, менее токсичных, чем лекарственные средства, используемые в настоящее время.

Производные камптотецина с открытым ароматическим кольцом демонстрируют высокое связывания с белком (в частности, с альбумином) и низкое распределение в опухолевой ткани. В результате продукт накапливается в организме и оказывает слабое действие на опухолевые клетки.

И наоборот, высокая липофильность лактонной формы усиливает адгезию производных камптотецина к клеточным мембранам, в частности мембранам эритроцитов, изменяя уровень соотношения распределения ткань/плазма. По этой причине исследование фокусируется на двух альтернативных подходах: а) разработка продуктов, обладающих низкой связываемостью с белком, но, тем не менее, высокой растворимостью; b) разработка продуктов с высоким потенциалом действия, обладающих терапевтическим эффектом даже в чрезвычайно низких дозах.

Модификации по положениям 7-, 9-, 10- и 11- обычно оказывались хорошо переносимыми, не влияя на стабильность тройного комплекса ДНК-Топоизомераза I-камптотецин, образование которого отвечает за противоопухолевую активность соединений.

Продукты конфигурации 20R оказались неактивными или менее активными, чем продукты конфигурации 20S, которая соответствует природной конфигурации.

Как правило, модификации в пятом положении считаются неблагоприятными для образования тройного комплекса, тогда как было показано, что модификации пиридоновых колец D и E негативно влияют на активность продукта.

РАСКРЫТИЕ ФОРМУЛЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к производным камптотецина общей формулы I:

где

R представляет алкил, аминоалкил, гидроксиалкил, нитрил, алкоксимино, арилоксимино, силилалкил;

R1 представляет водород, гидрокси, алкокси, аминоалкил;

R2 представляет водород, гидрокси, алкокси, аминоалкил, необязательно защищенную гидроксигруппу;

где алкил, алкокси, аминоалкил или алкоксиминогруппы могут содержать от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, в прямой или разветвленной цепи, тогда как арилоксиминогруппа может содержать от 5 до 10 атомов углерода;

их фармацевтически приемлемые соли, изомеры, энантиомеры, диастереомеры и соответствующие смеси.

Соединения изобретения демонстрируют низкую связываемость с белком и имеют хорошую растворимость и высокую эффективность даже в очень низких дозах.

Предпочтительный путь синтеза для получения соединений изобретения показан на следующей схеме и включает следующие основные стадии:

а) защита предшествующих гидроксигрупп;

b) модификация по 5-му положению N,N-дизащищенным гидразином;

c) необязательное преобразование пиридонового кольца в тиопиридоновое кольцо;

d) удаление защитных групп с сопутствующей циклизацией;

e) необязательная ароматизация пиразолового кольца.

В схеме R, R1 и R2 имеют значения, указанные выше, а PG является защитной группой для гидроксигруппы.

Гидроксигруппы обычно защищают с помощью легко удаляемых ацильных групп, предпочтительно трихлорацетатом и Troc (C(O)CH₂CCl₃), или силиловыми группами, предпочтительно триэтилсилилом (TES).

Модификация по 5-му положению защищенным гидразином может быть получена при обработке предшественника сильным органическим основанием, таким как LiHMDS (гексаметилдисилазид лития), и взаимодействием полученного карбаниона с азадикарбоксилатом, таким как ди-трет-бутоксиазадикарбоксилат или дибензилоксиазадикарбоксилат. Преобразование пиридонового кольца в тиопиридоновое кольцо может быть получено с помощью реакции с 2,4-бис(4-метоксифенил)-1,2,3,4-дитиафосфэтан-2,4-дисульфид (более известным как реагент Лоуссона) (Cava P.M. et al., Tetrahedron 1985, 41, 5061; Cherkasov R.A. et al., Tetrahedron 1985, 41, 2567; Ghattas A.A.G. et al., Sulfur Lett. 1982, 1,69; Yde B. et al., Tetrahedron 1984, 40. 2047) или эквивалентным реагентом. Реагент Лоуссона предпочтителен.

Целью необязательного преобразования в тиопиридон является обеспечение замыкания кольца после снятия защиты с гидразина. Однако было обнаружено, что указанная реакция замыкания кольца проходит спонтанно и немедленно даже без активации пиридинового карбонила, например тиокарбонила.

Когда защитными группами для гидроксигрупп являются силильные группы, а для азота - карбаматы, их обычно удаляют трихлоруксусной кислотой. В альтернативном методе стадии b) и c) можно поменять местами.

Соединения данного изобретения тестировали на цитотоксичность на широком спектре опухолевых клеток. В качестве примера приведены данные по цитотоксичности на клеточную линию NCI-H460 (клетки крупноклеточного рака легких) для двух соединений формулы (I) с использованием камптотецина и лекарственных средств Топотекан и SN-38 в качестве контролей:

Название Формула NCI-H460
IC₅₀(мкг/мл)
Количество клеток Камптотецин 0,115±0,0174 Топотекан 0,63±0,044 SN-38 0,0865±0,0049 IDN 6132 17±4,25 IDN 6137 3,8±1,08

Для наиболее активных соединений проводили тест на расщепление ДНК, измеряя активную концентрацию и устойчивость к повреждениям (см. раздел «Примеры»). Неожиданно производные формулы (I) показали более высокую устойчивость при блокировании репликации ДНК, чем контрольные стандарты (в частности, топотекан и камптотецин), при этом сохраняя высокую цитотоксическую активность.

Далее, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы (I) вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Фармацевтические формы, удобные для перорального или парентерального приема соединений (I), могут быть твердыми, предпочтительно капсулы, таблетки или гранулы, или жидкими, предпочтительно растворы для инъекций или инфузий.

Соединения изобретения в удобной для приема форме могут быть использованы для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легких, яичников, молочной железы, желудка, печени, простаты, саркомы мягких тканей, головы и шеи, пищевода, поджелудочной железы, толстой кишки, прямой кишки, глиобластомы, хронических и острых миелоидных лейкозов.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР I. 20-OTES-камптотецин

Камптотецин (0,100 г, 0,287 ммоль) суспендируют в сухом диметилформамиде (3 мл), в инертной атмосфере, к получившейся суспензии добавляют имидазол (0,980 г, 1,44 ммоль). Смесь перемешивают 10 минут, затем к ней по каплям добавляют триэтилсилилхлорид (TES-Cl) (0,193 мл, 1,15 ммоль), с последующим добавлением 4-диметиламинопиридин (DMAP) (0,040 г, 0,287 ммоль). Через 46 часов реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении (контроль полного исчезновения исходного вещества на тонкослойной хроматографии, элюент хлористый метилен:метанол = 30:1). Затем твердое вещество снова растворяют в хлористом метилене и отмывают водой и насыщенным хлоридом аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (2×10 мл). Органические слои смешивают и высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении с получением целевого продукта (0,133 г, 0,287 ммоль) в виде светло-желтого твердого вещества.

¹H ЯМР(CDCl₃, 400 МГц) δ 8,37 (с, 1Н, Ar, H-7), 8,25 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,92 (д, 1Н, J=8,0 Гц, Ar), 7,82 (т, 1Н, J=8,0 Гц, Ar ), 7,65 (т, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,57 (с, 1Н, Н-14), 5,67 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,29 (c, 2H, H-5), 5,25 (д, 1Н, J=16,4 Гц, Н-17), 2,00-1,84 (м, 2Н, Н-19), 1,03-0,93 (м, 12Н), 0,80-0,71 (м, 6Н). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 171,7, 157,6, 152,5, 151,5, 149,0, 145,9, 130,9, 130,4, 130,0, 128,4, 128,1, 128,0, 127,9, 118,9, 94,4, 75,3, 66,0, 50,0, 33,2, 7,9, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР II. Получение 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина

Камптотецин 20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждают до -78°С и по каплям добавляют к смеси 1,0 М раствор LiHMDS в тетрагидрофуране (0,281 мл, 0,281 ммоль). Через 20 минут добавляют раствор ди-трет-бутилазодикарбоксилата (DTBAC) (0,075 г, 0,324 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (2 мл). После 4 часов при -78°С исчезновение реагента проверяют тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:1). Наблюдают образование двух диастереомеров. Реакцию прерывают добавлением насыщенного хлорида аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:1), таким образом получая смесь двух изомеров (0,145 г, 0,210 ммоль, выход 97%). Два изомера разделяют с помощью дальнейшей хроматографии. В порядке элюции:

1^й диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,80 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,23 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1Н, Ar), 7,90-7,71 (м, 2Н, Ar), 7,70-7,45 (м, 2Н, Ar+, H-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,61 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 5,23 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,81 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,08 (ушир.с, 18Н), 1,06-0,92 (м, 12Н), 0,80-0,70 (м, 6Н). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 171,7, 157,8, 155,5, 155,5, 152,0, 152,0, 151,2, 149,4, 145,0, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,7, 81,5, 79,7, 75,2, 65,7, 33,2, 28,3, 27,6, 7,7, 7,2, 6,4.

2^й диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,79 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,23 (д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 8,01 (ушир.д, 1Н, Ar), 7,85-7,76 (м, 2Н, Ar), 7,65 (ушир.т, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,52 (с, 1Н, H-14), 6,54 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,61 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 5,22 (д, 1Н, J=16,8 Гц, H-17), 2,03-1,82 (м, 2Н, Н-19), 1,76-1,08 (ушир.с, 18 Н), 1,04-0,92 (м, 12Н), 0,80-0,70 (м, 6Н). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 171,5, 157,9, 155,5, 155,5, 152,3, 152,0, 151,2, 149,4, 145,1, 132,1, 130,6, 130,0, 128,7, 128,4, 127,9, 119,9, 98,2, 82,9, 81,5, 79,6, 75,2, 65,8, 33,3, 28,3, 27,4, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР III. Получение 1 ^го диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Первый диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (4 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, по каплям добавляя в смесь Et₃N•3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 35 часов при комнатной температуре, проверяя исчезновение реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,041 г, 0,071 ммоль, выход 98%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, м.д.: 8,77 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,16 (ушир.д, 1Н, J=8,0 Гц, Ar), 7,97 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,86-7,50 (м, 4 Н, Ar), 6,51 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,66 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,24 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 3,86 (ушир.с, 1Н, OH), 2,00-1,80 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18 Н), 1,03 (т, 3Н, J=7,6 Гц, Ме). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 173,7, 157,9, 155,5, 155,5, 152,1, 151,3, 150,7, 149,6, 145,7, 132,3, 130,7, 129,9, 128,7, 127,9, 127,6, 120,0, 97,9, 82,8, 81,6, 79,7, 72,7, 66,1, 31,8, 28,3, 27,7, 7,7.

ПРИМЕР IV. Получение 2 ^го диастереомера 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Второй диастереомер 5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,050 г, 0,072 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (4,5 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et₃N•3HF (0,088 мл, 0,542 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 35 часов при комнатной температуре, проверяя исчезновение реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,040 г, 0,069 ммоль, выход 96%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,79 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,22 (ушир.д, 1Н, J=8,4 Гц, Ar), 7,99 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,88-7,50 (м, 4 Н, Ar), 6,53 (ушир.с, 1Н, Н-5), 5,65 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 5,26 (д, 1Н, J=16,4 Гц, H-17), 3,80 (ушир.с, 1Н, OH), 2,00-1,80 (м, 2Н, Н-19), 1,79-1,13 (ушир.с, 18 Н), 1,03 (т, 3Н, J=7,2 Гц, Ме). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 173,6, 157,9, 155,4, 155,4, 152,1, 151,3, 150,8, 149,5, 145,6, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7, 127,9, 127,8, 119,8, 98,0, 83,0, 81,5, 79,7, 72,7, 66,3, 31,8, 28,3, 27,7, 7,8.

ПРИМЕР V. Получение 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина

Камптотецин-20-OTES (0,100 г, 0,216 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем охлаждают до температуры -78°С и по каплям добавляют 1,0 М раствор LiHMDS в тетрагидрофуране (0,281 мл, 0,281 ммоль). Через 20 минут добавляют раствор дибензилазодикарбоксилата (0,097 г, 0,324 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (2 мл). После 3 часов при -78°С температуру смеси оставляют подниматься до 25°С, после чего отсутствие реагента проверяют тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:1). Наблюдают образование двух диастереомеров. После 90 минут при комнатной температуре реакцию прерывают добавлением насыщенного хлорида аммония. Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 4:1, затем 7:2), таким образом получая светло-желтое твердое вещество (0,161 г, 0,212 ммоль, выход 98%). В дальнейшем два изомера разделяют с помощью хроматографии. В порядке элюции:

1^й диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,70 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,39 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,22 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.д, 1Н, J=7,6 Гц, Ar), 7,83 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,64-7,00 (м, 11Н, Ar+Н-14), 6,49 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,57 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,47-4,44 (м, 5Н), 1,98-1,82 (м, 2H, H-19), 1,02-0,89 (м, 12H), 0,80-0,70 (м, 6H). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 171,6, 158,0, 156,3, 156,3, 153,0, 152,2, 151,0, 149,6, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 130,0, 128,6-127,8 (11 С), 119,9, 98,4, 79,5, 75,2, 68,4, 67,9, 65,6, 33,0, 7,9, 7,2, 6,4.

2^й диастереомер: ¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,85 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,58 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,20 (шир. c, 1H, Ar), 7,93 (ушир. c, Ar), 7,81 (ушир.т, 1Н, J=7,6 Гц, Ar), 7,63 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,56-6,90 (м, 11Н, Ar+Н-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,8 Гц, H-17), 5,44-4,71 (м, 5Н), 1,98-1,80 (м, 2H, H-19), 1,05-0,90 (м, 12H), 0,81-0,70 (м, 6H). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 171,5, 157,9, 156,4, 156,4, 152,9, 152,4, 150,9, 149,4, 144,8, 135,3, 132,1, 130,6, 129,9, 128,6-127,8 (11 С), 119,9, 98,5, 79,3, 75,2, 68,4, 67,8, 65,6, 32,9, 7,8, 7,2, 6,4.

ПРИМЕР VI. Получение 1 ^го диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Первый диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et₃N•3HF (0,225 мл, 1,380 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 52 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 1:3). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 1:1, затем 3:2), таким образом получая целевой продукт (0,113 г, 0,175 ммоль, выход 95%) в виде светло-желтого твердого вещества. Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,67 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,39 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,12 (ушир.д, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,95 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,74 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,65-6,66 (м, 12H, Ar+Н-14), 6,48 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,55 (д, 1H, J=16,0 Гц, H-17), 5,42-4,44(м, 5 Н), 3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,92-1,72 (м, 2H, H-19), 0,95 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 173,5, 158,0, 156,2, 156,0, 153,0, 150,9, 150,9, 149,5, 145,3, 135,4, 132,2, 130,7, 129,8, 128,7-127,8 (11 С), 119,9, 98,2, 79,6, 72,7, 68,5, 68,0, 65,9, 31,6, 7,8.

ПРИМЕР VII. Получение 2 ^го диастереомера 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OH-камптотецина

Второй диастереомер 5-дибензилоксикарбонилгидразино-20-OTES-камптотецина (0,140 г, 0,184 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране (6 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем по каплям добавляя в смесь Et₃N•3HF (0,150 мл, 0,921 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 55 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 3:2). Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлении, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, гексан:этилацетат = 1:1), таким образом получая целевой продукт (0,113 г, 0,175 ммоль, выход 95%) в виде светло-желтого твердого вещества.

Далее продукт очищают кристаллизацией из хлористого метилена:пентана = 1:50.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,71 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,34 (ушир.с, 1Н, Ar), 8,18 (ушир.с, 1H, Ar), 7,94 (ушир.с, 1Н, Ar), 7,79 (ушир.т, 1H, J=7,6 Гц, Ar), 7,70-6,70 (м, 12H, Ar+Н-14), 6,52 (ушир.с, 1Н, H-5), 5,53 (д, 1H, J=16,4 Гц, H-17), 5,44-4,48 (м, 5Н), 3,87 (ушир.с, 1H, OH), 1,90-1,70 (м, 2H, H-19), 0,99 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 173,4, 158,0, 156,3, 156,1, 153,0, 151,0, 150,9, 149,6, 145,3, 135,5, 132,3, 130,8, 129,8, 128,7-127,8 (11 С), 119,8, 98,4, 79,5, 72,7, 68,5, 68,0, 67,8, 66,0, 31,6, 7,7.

ПРИМЕР VIII. Получение соли 4,5-дигидротриазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина трифторуксусной кислоты

5-ди-трет-бутоксикарбонилгидразино-20-OTES-камтотецин (0,225 мг, 0,324 ммоль, диастереомерная смесь 1:1) растворяют в сухом 1,2-дихлорэтане (ДХЭ) (8 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем добавляя по каплям трифторуксусную кислоту (ТФУ) (0,895 мл, 11,67 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 20 часов при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (гексан:этилацетат = 1:3), затем кипятят 4 часа с обратным холодильником. Растворитель удаляют отгонкой при пониженном давлением, полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, хлористый метилен:метанол = 30:1), таким образом, получая целевой продукт (0,084 г, 0,178 ммоль, выход 55%) в виде соли трифторуксусной кислоты. Далее эквимолярную смесь двух диастереомеров очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, толуол: этилацетат = 1:1).

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 10,61 (ушир.с, 0,5H, N5-NH=C16a), 10,39 (ушир.с, 0,5H, N5-NH=C16a), 8,67 (с, 1H, Ar, H-7), 8,22-8,15 (м, 1Н, Ar), 7,96-7,92 (м, 1Н, Ar), 7,88-7,78 (м, 1Н, Ar), 7,69-7,60 (м, 2Н, Ar), 6,38-6,36 (м, 1Н, Ar, H-5), 5,72-5,62 (м, 1Н, Ar, H-17), 5,32-5,20 (м, 2Н, Ar, H-17+N5H), 4,08-3,86 (ушир.с, 1H, OH), 1,96-1,74 (м, 2H, H-19), 1,05-0,98 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 173,8 (0,5 C), 173,4 (0,5 C), 159,1, 159,0, 156,7 (кв CF₃COOH), 156,5 (кв CF₃COOH), 151,5, 151,3, 150,7, 150,5, 150,1, 149,9, 144,8, 144,7, 134,0, 133,8, 131,6, 131,5, 129,9, 129,8, 128,7, 128,7, 128,4, 128,4, 128,2, 128,2, 127,1, 126,9, 120,5, 120,3, 99,1 (2 C), 78,9, 78,6, 72,7, 72,7, 66,0 (2 C), 31,7 (2 C), 7,7, 7,7.

ПРИМЕР IX. Получение триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина

Cоль 4,5-дигидротриазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецина трифторуксусной кислоты (0,020 г, 0,042 ммоль) растворяют в сухом хлористом метилене (4 мл) при перемешивании в инертной атмосфере, затем добавляя 2,3-дихлоро-5,6-дициано-пара-бензохинон (ДДХ) (0,025 мг, 0,110 ммоль). Реакционной смеси позволяют взаимодействовать в течение 31 час при комнатной температуре, проверяя отсутствие реагента тонкослойной хроматографией (хлористый метилен:метанол = 30:1). Реакцию прерывают добавлением воды.

Водный слой экстрагируют хлористым метиленом (3×15 мл), органические слои смешивают, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают колоночной флэш-хроматографией (силикагель, хлористый метилен:метанол = 45:1), таким образом получая светло-желтое твердое вещество (0,014 г, 0,039 ммоль, выход 94%).

¹H ЯМР (CDCl₃, 400 МГц) δ, 8,89 (с, 1H, Ar, H-7), 8,20 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 8,00 (д, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,88 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 7,79 (с, 1Н, Ar, H-14), 7,69 (т, 1H, J=8,4 Гц, Ar), 5,70 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 5,28 (д, 1H, J=17,2 Гц, H-17), 3,83 (ушир.с, 1H, OH), 2,00-1,74 (м, 2H, H-19), 1,08 (т, 3H, J=7,6 Гц, Me). ¹³С ЯМР (CDCl₃, 100 МГц) δ, 172,6, 157,4, 152,5, 150,8, 148,9, 143,7, 134,9, 132,5, 132,4, 130,0, 129,5, 128,7, 127,5, 122,6, 121,4, 101,2, 72,4, 66,0, 31,6, 7,7.

ПРИМЕР X. Тест на цитотоксичность

Клетки H460 крупноклеточного рака легких человека культивировались в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS (эмбриональной сыворотки телят). Чувствительность клеток оценивали по ингибированию роста культуры после 1 или 72 часов инкубации с лекарственным средством. Клетки в логарифмической фазе роста собирали и в дупликатах высеивали на 6-луночные планшеты. Через 24 часа после пассажа клетки инкубировали с лекарственными средствами и через 72 часа после инкубации с лекарственными средствами на цитометре подсчитывали количество клеток для расчета IC₅₀. IC₅₀ определяется как концентрация вещества, при которой происходит подавление роста 50% клеток по сравнению с негативным контролем.

ПРИМЕР XI. Тест на топоизомераза I-зависимые разрывы ДНК

Разрывы ДНК определяли при помощи 751 bp BamHI-EcoRI ДНК-SV-40 очищенного геля (Beretta GL, Binaschi M, Zagni AND, Capuani L, Capranico G. Связывание топоизомеразы типа IB с сайтом ДНК при слиянии фермента с гетерологичным сайт-селективным ДНК-связывающим доменом белка. Cancer Res 1999; 59:3689-97). Фрагменты ДНК были мечены только по 3' концу. Реакцию разрыва ДНК (20000 копий в минуту/образец) проводили в 20 мл 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ хлорида калия, 5 мМ хлорида магния, 15 мкг/мл БСА (бычий сывороточный альбумин), 0,1 мМ тиотреитола и человеческого рекомбинантного фермента (top1 полной длины) 30 минут при 37°С. Реакции блокировали при инкубации в течение 45 минут при 42°С с 0,5% SDS (додецилсульфат натрия) и 0,3 мг/мл протеиназы К. Устойчивость повреждений ДНК проверяли в разное время, добавляя 0,6 М хлорид натрия после 30 минут инкубации с лекарственным средством. После преципитации ДНК ресуспендировали в денатурирующем буфере (80% формамид, 10 мМ гидроксид натрия, 0,01 М ЭДТА и 1 мг/мл красителя) перед переносом в денатурирующий гель (7% полиакриламид в TBE буфере). Все степени разрыва ДНК детектировали на приборе Phospholmager 425 (Molecular Dynamics) (Dallavalle S., Ferrari A., Biasotti B. et al. Новые производные 7-оксииминометилкамптотецина с потенциальной противоопухолевой активностью in vitro и in vivo. J. Med. Chem. 2001; 44: 3264-74).

Устойчивость повреждений ДНК (%) Соединения Время (мин)   0 1 5 10 Топотекан 100 65 20 10 Камптотецин 100 58 23 20 SN-38 100 60 33 28 IDN 6132 100 45 32 20

Описываются новые производные камптотецина-4,5-дигидротриазол [5,4-с]16а-дезоксокамптотецин и триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецин, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция, их содержащая, и применение их в качестве противоопухолевых лекарственных средств. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Производное камптотецина, выбранное из группы, включающей:
a) 4,5-дигидротриазол [5,4-с]16а-дезоксокамптотецин,
b) триазол[5,4-с]16а-дезоксокамптотецин.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая соединение по п.1 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксцепиентами.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, в форме, удобной для перорального или парентерального приема.

4. Применение соединения по п.1 или композиции по пп.2, 3 для получения лекарственного средства для лечения опухолей.

5. Применение по п.4, где указанное лекарственное средство применяют для лечения солидных опухолей и лейкозов, в частности опухолей легкого, яичников, молочной железы, желудка, печени, простаты, сарком мягких тканей, пищевода, поджелудочной железы, головы и шеи, глиобластомы, хронических и острых миелоцитарных лейкозов.