ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ФОРМА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭРИТРОПОЭТИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K9/20 A61K38/22 A61P7/06 

Изобретение относится к медицине, в частности к производству медико-биологических лекарственных препаратов.

Эритропоэтин (ЭПО) - это гормон, продуцируемый интерстициальными клетками почек и регулирующий эритропоэз у млекопитающих. Эритропоэтин предназначен для лечения таких заболеваний, как анемия, вызванная хронической почечной недостаточностью и истинной полицитемией, анемия, вызванная артритом, до- и поcлехирургическими осложнениями или противовирусной терапией, а также для лечения больных детей раннего возраста, страдающих гипотрофией и анемией алиментарно-инфекционной этиологии.

Известен способ получения инъекционной формы рекомбинантного эритропоэтина [1, 2].

Терапевтический эффект рекомбинантного человеческого эритропоэтина для парентерального (инъекционного) применения несомненен и описан во многих работах. Но в этих же работах описано и побочное нежелательное действие этого препарата, приводящее к различным осложнениям. Побочные эффекты от лечения парентеральной лекарственной формой рекомбинантного человеческого эритропоэтина могут быть вызваны чрезмерным превышением вводимой дозы эритропоэтина по сравнению с физиологической, что нежелательно и создает дополни тельный риск для больного [3].

Известен способ введения ЭПО в легкие в виде аэрозоля - аэрозольный путь введения [4].

Известны оральные препараты белковых лекарственных веществ [5], в том числе эритропоэтин. Указанная оральная форма эритропоэтина представляет собой фармацевтический препарат в виде микрокапсул, заключенных в общую желатиновую капсулу, которая растворяется в кишечнике. Способ приготовления микрокапсулированной формы эритропоэтина достаточно сложный и требует введения нескольких дополнительных веществ для стабилизации гормона и предотвращения его ферментативной инактивации в процессе хранения. Кроме того, обязательно вводятся поверхностно-активное вещество и антимикробные агенты.

Технической задачей изобретения является создание лекарственной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения, которая позволит лечить анемию у большого количества больных, которое исключает возможность заражения больных (через шприц) вирусами иммунодефицита, гепатитов и других, инфекционных заболеваний и вое вышеуказанное позволит проводить курс лечения, длительность которого составляет 4-8 недель, вне клиники.

Поставленная задача решается получением таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина.

Препарат рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рабочее название "Репорон"), представляет собой сладкие таблетки двояковыпуклой формы со вкусом и запахом ванилина. Таблетка состоит из кислотоустойчивой оболочки на основе ацетилфталилцеллюлозы и ядра, которое содержит рекомбинантный человеческий эритропоэтин в дозе 100-2000 ед. на таблетку, стабилизаторы (желатозу, сахарозу, мочевину); наполнители (стеарат кальция, лактозу), ванилин при следующем соотношении компонентов ядра таблетки, мас. %:
Желатоза - До 3 - 5%
Сахароза - 3 - 5%
Мочевина - 1 - 2%
Лактоза - 25 - 37%
Стеарат кальция - До 2%
Ванилин - Дo 0,2%
Эритропоэтин в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку - Остальное
Входными воротами для гормона при терапии является слизистая оболочка полости рта, глотки и тонкого кишечника.

Сущность предлагаемого способа получения пероральной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина.

Способ получения таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина включает в себя следующие стадии;
1) Стерильный раствор рекомбинантного человеческого эритропоэтина в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку смешивают со стерильным водным раствором стабилизаторов: 25%-ной желатозой, 50%-ной сахарозой, 10%-ной мочевиной, асептически заливают во флаконы и лиофильно высушивают;
2) Сухой полуфабрикат эритропоэтина смешивают с наполнителями: лактозой в соотношении 2 : 1 (по массе), стеаратом кальция, ванилином и прессуют ядро таблетки двояковыпуклой формы, которые затем покрывают кислотоустойчивой пленкой на основе ацетилфталилцеллюлозы при следующем соотношении компонентов ядра таблетки, мас.%:
Желатоза - До 3 - 5%
Сахароза - 3 - 5%
Мочевина - 1 - 2%
Лактоза - 25 - 37%
Стеарат кальция - До 2%
Ванилин - До 0,2%
Эритропоэтин в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку - Остальное
Таким образом, получают гормональный препарат, предназначенный для лечения больных детей раннего возраста, страдающих гипотрофией и анемией алиментарно-инфекционной этиологии; больных, страдающих анемией, вызванной хронической почечной недостаточностью и истинной полицитемией; пациентов с анемией, вызванной до- и послехирургическими осложнениями, и др., путем приема перорально таблеток. Это исключает возможность заражения пациента вирусами иммунодефицита, гепатитов и других, инфекций, что возможно при парентеральных способах введения. Специально подобранный состав стабилизаторов и наполнителей позволяет исключить побочные эффекты, вызываемые добавками.

Предложенный способ получения пероральной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина не известен из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о соответствии критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Ниже следуют примеры осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1. Приготовление сухого полуфабриката эритропоэтина. К стерильному раствору рекомбинантного человеческого эритропоэтина с активностью 1000 ед. /табл. добавляют стерильные водные растворы 50% сахарозы до 5% (по массе), 25% желатозы до 5% (по массе) и 10% мочевины до 1% (по массе). Стерильные растворы в асептических условиях заливают во флаконы объемом по 50 мл и сублимационно высушивают в лиофильной установке в специально подобранном режиме. Сухой полуфабрикат эритропоэтина используют на стадии изготовления ядра таблеток. Качество сушки препарата контролируют по остаточной влажности и активности. Эритропоэтин в сухом виде при хранении в течение года (время наблюдения) при -20 ^oС не теряет свою активность.

Проверка биологической активности сухого эритропоэтина (при испытаниях сухой ЭПО переводят в растворимую форму) на мышах показывает увеличение содержания ретикулоцитов (на 1000 эритроцитов) в крови животных после введения 50 ед. эритропоэтина инъекционно: исходное - 4,2; 3-ий день - 10,35; 4-ый день - 16,0.

Пример 2. Приготовление экспериментальных образцов таблетированной формы ЭПО. Сухой полуфабрикат ЭПО, полученный так, как указано в примере 1, смешивают с лактозой в соотношении 1 : 2 (по массе), добавляют стеарат кальция и ванилин. Из полученной массы прессуют ядро таблетки двояковыпуклой формы. Готовые таблетки покрывают кислотоустойчивым покрытием на основе ацетилфталилцеллюлозы, защищающим действующее начало таблетированного препарата от воздействия желудочного сока. Наполнители добавляют при следующих соотношениях: лактоза 25 - 37%, стеарат кальция до 2%. Ванилин составляет до 0,2%. Полученные рецептурные формы эритропоэтина обладают специфической активностью, стабильны при хранении в интервале температур от +4^oC до +25^oC (время наблюдения). Проверка биологической активности таблетированного препарата на мышах после введения 50 ед. таблетки per os показывает увеличение содержания ретикулоцитов (на 1000 эритроцитов) в крови животных: исходное - 4,4; 3-ий день - 9,1; 4 -ый день - 11,8.

Пример 3. Приготовление экспериментальных образцов таблетиро-ванной формы ЭПО. Сухой полуфабрикат ЭПО, полученный так, как указано в примере 1, смешивают с лактозой в соотношении 2 : 1 (по массе), добавляют стеарат кальция и ванилин. Из полученной массы прессуют ядро таблетки двояковыпуклой формы. Готовые таблетки покрывают кислотоустойчивым покрытием на основе ацетилфталилцеллюлозы, защищающим действующее начало таблетированного препарата от воздействия желудочного сока. Наполнители добавляют при следующих соотношениях: лактоза 25 - 37%, стеарат кальция до 2%. Ванилин составляет до 0,2%. Полученные рецептурные формы эритропоэтина обладают специфической активностью, стабильны при хранении в интервале температур от +4^oC до +25^oC (время наблюдения). Проверка биологической активности таблетированного препарата на мышах после введения 50 ед. таблетки per os показывает увеличение содержания ретикулоцитов (на 1000 эритроцитов) в крови животных: исходное - 4,4; 3-ий день - 8,2; 4-ый день - 10,6.

Пример 4. Изучение таблетированной формы ЭПО на токсичность. Токсичность для лабораторных, животных определяют в соответствии с методикой [6]. Для определения токсичности берут пять таблеток одной серии, стерильно растирают, растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия, осветляют центрифугированием и вводят подкожно по 5 мл двум беспородным морским свинкам в возрасте 3-х месяцев о массой тела (300 ± 50) г и по 0,2 мл пяти беспородным белым мышам в возрасте 2-х месяцев и массой тела 17-20 г. Все животные остаются живы в течение 7 суток, масса каждого животного не уменьшается по сравнению с исходной на день окончания эксперимента. На месте введения не развивается абсцесс или некроз, не отмечается повышения температуры ни у одного животного.

Пример 5. Изучение специфической активности таблетированной формы ЭПО in vivo. Специфическую активность таблетированной формы ЭПО in vivo проверяют на мышах C57BL. Тестирование in vivo осуществляют измерением интенсивности эритропоэза. Интенсивность эритропоэза у мышей регистрируют, измеряя концентрацию клеток предшественников эритроцитов - ретикулоцитов в крови животных. Концентрацию ретикулоцитов измеряют в пробах крови, взятых в различные дни до и после инъекции препаратов ЭПО. Пробу крови берут из орбитальной вены и смешивают с антикоагулянтом (2%-й раствор цитрата натрия в физрастворе). Затем в пробу добавляют раствор креазолового синего в физрастворе и проводят суправитальное окрашивание клеток крови в течение 30-40 мин при комнатой температуре. После этого делают мазок крови на предметном стекле и проводят учет количества ретикулоцитов на 1000 эритроцитов под микроскопом.

Вводят per os таблетку с определенной дозой ЭПО гипоксическим полицитемическим мышам (по 5 в каждой группе) и контролируют содержание ретикулоцитов в крови ежедневно в течение 4-х дней. Результаты тестирования 3-х серий "Репорона" представлены в табл. 1. Контрольная группа мышей получает наполнитель (таблетки, не содержащие эритропоэтин) per os.

Проведенные исследования выявляют повышение ретикулоцитов в крови животных после перорального введения гормона в таблетированной форме.

Пример 6. Проведение сравнительного изучения разных форм ЭПО. По данному способу, описанному в примере 2, получено 10 серий гормона. Сравнительная характеристика разработанного перорального препарата "Репорона" и инъекционного препарата "Epogen", разработанного фирмой "Amgen" (США) [7], приведена в таблице 2.

Как видно из данных таблицы 2, гормональный препарат "Репорон" позволяет проводить терапию анемии без угрозы передачи вируcов иммунодефицита, гепатитов и других инфекций больному. Для лечения не требуется наличия квалифицированного медицинского персонала и госпитализации в клинике, терапия, в случае применения "Репорона", вполне допустима в домашних условиях (вне клиники).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Николаев А. Ю., Клепиков П.В., Лашутин С. В., Кухтевич А. В. Эффективность сочетания эритропоэтин-кальцитриол у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на программном гемодиализе. Терапевтический архив. 1995, т. 67, N 5, с.27-31.

2. Патент СССР N 1801118. Способ получения человеческого эритропоэтина, 1994г.

3. Синюхин В.Н. и др. Фармакокинетика рекомбинантного человеческого эритропоэтина. Терапевтической архив, 1994, Т. 66, N 8, с.60-62.

4. Международная заявка N 94/17784. Легочное введение эритропоэтина, 1994.

5. Патент США N 5206219. Оральные препараты белковых лекарственных веществ, 1993.

6. Государственная Фармакопея СССР, 11 изд., вып. 2, М., Медицина, 1989.

7. Патент СССР N 1801118. Способ получения человеческого эритропоэтина, 1994.

Изобретение относится к медицине, в частности к производству медико-биологических препаратов, и касается пероральной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, который используется для лечения различных форм анемии. Форму получают смешиванием эритропоэтина со стабилизирующими добавками в определенных пропорциях, при этом доза эритропоэтина составляет 100-2000 ед./табл., и лиофилизации. Лиофильно высушенный эритропоэтин смешивают с лактозой, стеаратом кальция и ванилином и прессуют в таблетки, которые затем покрывают кислотоустойчивой оболочкой. Полученная форма более удобна для приема, более стабильна в процессе хранения. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения, включающая кислотоустойчивую оболочку, в качестве которой используют ацетилфталилцеллюлозу, и ядро, содержащее эритропоэтин в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку; стабилизаторы, желатозу, сахарозу, мочевину; наполнители: стеарат кальция, лактозу, ванилин, мас.%:
Желатоза - До 3 - 5
Сахароза - 3 - 5
Мочевина - 1 - 2
Лактоза - 25 - 37
Стеарат кальция - До 2
Ванилин - До 0,2
Эритропоэтин в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку - Остальное
2. Способ получения таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина, заключающийся в том, что стерильный раствор рекомбинантного человеческого эритропоэтина в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку смешивают со стерильным водным раствором стибилизаторов: 25-%-ной желатозой, 50%-ной сахарозой, 10%-ной мочевиной, лиофильно высушивают, а потом добавляют наполнители: лактозу, стеарат кальция, ванилин и прессуют ядро двояковыпуклой таблетки, которую покрывают кислотоустойчивой оболочкой на основе ацетилфталилцеллюлозы при следующем соотношении компонентов ядра таблетки, мас.%:
Желатоза - До 3 - 5
Сахароза - 3 - 5
Мочевина - 1 - 2
Лактоза - 25 - 37
Стеарат кальция - До 2
Эритропоэтин в дозе 100 - 2000 ед. на таблетку - Остальное