ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ФОРМА РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭРИТРОПОЭТИНА Российский патент 2002 года по МПК A61K38/22 A61K47/42 A61K9/36 A61P7/06 

Изобретение относится к фармакалогии и медицине, а именно к получению таблетированного стабильного препарата рекомбинантного эритропоэтина, который может быть использован для лечения различных анемических состояний.

Эритропоэтин, гликопротеидный гормон, являясь физиологическим регулятором эритропоэза, определяет количество эритроцитов в периферической крови млекопитающих. С каждым годом в клинической практике расширяется спектр анемических состояний, для которых выявлен выраженный терапевтический эффект экзогенного рекомбинантного эритропоэтина. Однако парентеральное введение препарата наряду с возможностью инфицирования и инвазивностью вызывает также ряд побочных эффектов, обусловленных, в частности, гипертензией вследствие резкого возрастания эритроцитарной массы и вязкости крови. Таким образом, актуальна задача создания пероральной альтернативной формы эритропоэтина, которая была бы лишена этих недостатков и, судя по экспериментальным данным [1] , изменила бы фармакодинамику препарата в сторону сглаженного и более пролонгированного эффекта.

Эритропоэтин достаточно нестабилен и может терять свою активность как на этапах создания готовой формы препарата, так и при хранении в результате воздействия факторов окружающей среды. С целью минимизации потерь активности гормона используются различные комбинации стабилизаторов, в качестве которых используются полимерные соединения, белки и аминокислоты, сахара, тиольные восстановители, минеральные и органические соли. Однако многие препараты эритропоэтина, приобретая достаточную устойчивость (по результатам тестирования in vitro), теряют специфическую активность в экспериментах in vivo.

В отечественной практике разработан ряд стабильных водных и лиофилизированных препаратов эритропоэтина. Один из них - инъекционный стабилизированный водный раствор гормона содержит в качестве стабилизатора декстран с молекулярной массой 30000-60000 в концентрации 6-10%, а также цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и рН раствора 6,5-7,5. Данный препарат сохраняет активность до 2-х лет при хранении в условиях 2-8^oС [2].

Известен инъекционный лиофилизат эритропоэтина, содержащий для стабилизации мочевину в количестве 10-15 г/л, смесь аминокислот в количестве 4-24 г/л, физиологически пригодный буфер, а также хлористый кальций в качестве комплексообразователя. Указанный препарат устойчив в атмосфере азота в течение 2-х лет при 0^oС [3]. Однако все вышеуказанные формы препаратов не являются пероральными.

Наиболее близким по составу и способу введения к предлагаемому препарату является таблетированная форма эритропоэтина [4, прототип], содержащая в качестве стабилизаторов желатозу 3-5%, сахарозу 3-5% и мочевину 1-2%.

Данная форма эритропоэтина после стабилизации и получения конечной формы сохраняет свою специфическую активность в экспериментах in vivo, однако к пятому месяцу хранения при температуре +4 - 10^oС потери активности по показаниям ИФА составляют 36% от первоначального уровня, при ускоренном хранении в условиях комнатной температуры падение активности достигает 50%.

Задачей изобретения является создание стабильной и безопасной пероральной формы эритропоэтина, сохраняющей специфическую активность в экспериментах in vivo, а также при длительном хранении.

Поставленная задача решается применением таблетированной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения, включающая кислотоустойчивую оболочку, в качестве которой используют ацетилфталилцеллюлозу, и ядро, содержащее очищенную субстанцию эритропоэтина в дозе 100-2000 ЕД на таблетку, фосфатно-солевой буфер; стабилизаторы: сахарозу, желатозу, пептон; наполнители: лактозу, стеарат кальция в соотношении, %:
Фосфатно-солевой буфер 0,025М - 25-50
Желатоза - 2-7
Сахароза - 2-7
Пептон мясной - 3-7
Стеарат кальция - 1
Лактоза - Остальное до 100
Эритропоэтин в дозе - 100-2000 Ед
В результате применения комбинации стабилизаторов: желатозы 2-7%, сахарозы 2-7%, пептона мясного 3-7% удается получить стабильную и безопасную пероральную форму эритропоэтина, сохраняющую специфическую активность в экспериментах in vivo, а также при длительном хранении.

Решающим в данном комплексе стабилизаторов является использование пептона мясного, который в совокупности с другими его компонентами обуславливает антиоксидантные свойства ди-, трипептидов [5]. Кроме того, пептон мясной, в отличие от нативных белковых препаратов, используемых для стабилизации, не является аллергеном, не может быть контаминирован вирусами и не содержит активных ингибиторов эритропоэза.

Для получения препарата субстанцию рекомбинантного эритропоэтина готовят путем сбора накопительной среды в процессе культивирования трансформированных клеток штамма-продуцента эритропоэтина, осветления фильтрованием культуральной жидкости, концентрирования на полых волокнах от 1:50 до 1:100 и очистки; концентрацию активного материала определяют твердофазным иммуноферментным методом. В соответствии с желаемой активностью готовых таблеток концентрат доводят до необходимого объема фосфатно-солевым буфером и соединяют с вышеуказанными стабилизаторами. Полученный жидкий полуфабрикат разливают в асептических условиях и подвергают сублимационному высушиванию. При лиофилизации препарата необходимое количество сухого остатка должно находится в пределах 7-15%. Режим замораживания - высушивания для системы стабилизаторов желатоза - сахароза (соотношение 1:1, м/м) был подобран ранее на основании изучения диаграммы физических состояний системы желатоза - сахароза - вода [6].

Таблетки прессуют из смеси сухого полуфабриката с наполнителями лактозой и стеаратом кальция. Для понижения гигроскопичности таблеток, что также влияет на стабильность гормона, содержание лактозы в конечной форме препарата доводят до 50-70% (весовое соотношение наполнителя к лиофилизированному полуфабрикату должно находится в пределах от 1:1 до 2:1). Готовые таблетки покрывают кислотоустойчивой пленкой на основе ацетилфталилцеллюлозы, защищающей действующее начало препарата от воздействия желудочного сока.

Таким образом, использование в качестве стабилизатора пептона мясного, подбор необходимого соотношения стабилизаторов, наполнителей и активной составляющей в таблетке позволили создать новую таблетированную форму эритропоэтина, стабильность которого сохранялась в течение 3-х лет при хранении при температуре +4^oС. Биологическая активность таблеток была определена как в экспериментах in vitro (на культуре клеток миелокариоцитов), так и in vivo (пероральное назначение мышам). При этом результаты тестирования не выявили различия по колониестимулирующей активности между исследуемым препаратом эритропоэтина и коммерческим "Recormon" (табл.2).

При введении мышам таблетированный препарат оказывает высоко специфическое активирующее влияние на эритроидный росток костного мозга, лишь в ранние сроки уступающее аналогичному при введении инъекционного препарата (табл.1). При подкожном введении животным в дозе 2000 ЕД/кг таблетированный препарат не оказывает токсического действия.

Пример 1. Приготовление лиофилизата эритропоэтина для серии из 100 таблеток с активностью 250 ЕД/таблетку.

Предварительно подготовленную, сконцентрированную и очищенную субстанцию рекомбинантного эритропоэтина подвергают стерилизующему фильтрованию (Millipore 0,22), определяют активность методом ИФА.

Желатозу получают в результате термического гидролиза желатина при одной избыточной атмосфере в течение 3,5 ч.

Растворы для приготовления жидкого полуфабриката эритропоэтина:
ФСБ (фосфатно-солевой буфер) 0,025М, стерилизован автоклавированием - 24 мл
50% раствор сахарозы на ФСБ, стерилизован фильтрованием - 18 мл
25% раствор желатозы на ФСБ, стерилизован автоклавированием - 38 мл
25% раствор пептона, стерилизован автоклавированием - 15 мл
Концентрат эритропоэтина (1600 ЕД/мл) - 31 мл
Все растворы в асептических условиях объединяют, разливают по 10 мл во флаконы объемом 50 мл и сублимационно высушивают в установке для лиофилизации при следующих условиях:
Основная сушка:
Время замораживания до -50^oС - 18 ч
Время сушки - 8 ч
Температура полки - -20^oС
Температура образца - -35^oС
Подъем температуры от -20^oС до +20^oС - Постепенно в течение 18 ч
Дополнительная сушка:
Время сушки - 5 ч
Температура образца - +35^o
Давление - 0,00005 атм
Пример 2. Приготовление экспериментальной серии таблеток эритропоэтина активностью 250 ЕД/таблетку, массой 250 мг в количестве 100 шт.

Состав ингредиентов для приготовления таблеток:
Лиофилизат эритропоэтина - 12 г
Лактоза - 12 г
Стеарат кальция - 0,48 г
Все компоненты смешивают. Из полученной массы прессуют таблетки двояковыпуклой формы и покрывают пленкой на основе ацетилфталилцеллюлозы. Остаточная влажность таблеток 1,7%. Полученные таблетки не содержат патогенной микрофлоры, сохраняют форму и не растворяются в воде. Препарат может храниться в герметически закрытых флаконах фактически без потери активности при +4^oС длительное время (более 3 лет). Данные по хранению (в сравнении с прототипом) приведены в табл.3.

Ускоренное хранение при температуре +22^oС также не выявило существенного падения активности эритропоэтина.

Пример 3. Исследование безвредности таблетированной формы эритропоэтина.

Токсические свойства или безвредность препарата изучают на белых беспородных мышах в возрасте 2 месяцев и массой тела 17-20 г, а также на беспородных морских свинках в возрасте 3 месяцев и массой 250-350 г. Для изучения токсического действия содержимое 5-ти таблеток одной серии в асептических условиях растирают, растворяют в 5 мл изотонического раствора хлорида натрия, осветляют центрифугированием и вводят подкожно по 5 мл 2-м морским свинкам и по 0,2 мл 5-ти мышам.

Введение препарата не приводило к нарушению поведенческих реакций, масса животных колебалась в пределах физиологической нормы, температура тела не изменялась, воспалительной реакции в месте введения не отмечалось.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что однократное подкожное введение препарата не оказывает токсического действия на организм животного.

Пример 4. Изучение специфической биологической активности таблетированной формы эритропоэтина in vivo.

Специфическую активность таблетированной формы ЭПО in vivo проверяют на мышах-самцах линии CBA/CaLac. Животным 1 раз в день в течение 5 суток назначают один из следующих препаратов: 1) физиологический раствор перорально в объеме 0,2 мл; 2) плацебо (инертный наполнитель таблеток) перорально в аналогичном объеме; 3) таблетки рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рчЭПО) с содержанием вещества 250 Ед активности по 5 ЕД/мышь (суммарная доза 25 ЕД/мышь; 4) подкожные инъекции рчЭПО ("Протеиновый контур", Санкт-Петербург) в эквивалентной дозе. После окончания курса введений у животных в течение последующих 5 дней определяют число эритроцитов и ретикулоцитов в периферической крови, общее количество кариоцитов (ОКК) в костном мозге бедренной кости, подсчитывают миелограмму.

Результаты исследования показывают, что назначение таблеток рчЭПО мышам приводит к стимуляции эритропоэза в костном мозге. На протяжении всего периода наблюдений (5 дней после введения препарата) абсолютное содержание эритрокариоцитов превышало более чем в 2-5 раз исходный уровень, табл.1) эритропоэзстимулирующая активность таблетированных форм рчЭПО в начальном периоде уступала аналогичному показателю для контрольного инъекционного раствора вследствие различий в фармакокинетике. Однако уже на вторые сутки после окончания курса введения количество эритроидных клеток в костном мозге при использовании таблеток составляло 500% от исходного уровня при парентеральном назначении. В последующие сроки специфическая активность рчЭПО в полученном препарате при пероральном введении не отличалась либо превосходила контрольные цифры при парентеральном введении инъекционного препарата.

Подкожная инъекция контрольного препарата вызывала выраженную резкую ретикулоцитарную реакцию в периферической крови (табл. 1), которая постепенно снижалась к концу исследования. Введение таблеток рчЭПО вызывало менее значительный ретикулоцитоз, однако данный показатель увеличивался более чем на 50% по сравнению с исходным уровнем. При этом число эритроцитов соответствовало контрольным цифрам (инъекционная форма) и достоверно превышало исходный уровень, что говорит в пользу ускоренного созревания ретикулоцитов.

Таким образом, данная таблетированная форма рчЭПО в дозе 5 ЕД/мышь оказывает высоко специфическое активирующее влияние на эритроидный росток костного мозга.

Пример 5. Изучение специфической биологической активности концентрированного стабилизированного раствора рчЭПО in vitro.

Эритропоэтическую активность раствора (1150 ЕД/мл) в сравнении со шведским препаратом "Recormon" определяют по способности стимулировать рост эритроидных колоний типа КОЕ-Э. В качестве тест-системы выступает метилцеллюлозная культура неприлипающих миелокариоцитов (10⁵ клеток/мл среды). Исследуемый раствор добавляют в различных конечных разведениях. Инкубацию осуществляют в 24-луночных планшетах в течение 3-х дней в атмосфере, насыщенной 3,5% CO₂ при 100% влажности. Под колониями подразумевали агрегаты, содержащие не менее 50 клеток.

Подсчет выросших колоний показал достоверное превышение их числа относительно контроля (без ЭПО) при использовании обоих препаратов во всем диапазоне исследуемых доз (табл. 2). Дозовая зависимость эффекта обнаружена в диапазоне концентраций от 0,5 до 1,5 ЕД/мл.

Таким образом, стабилизированный раствор рчЭПО обладает эритропоэтической активностью, не выявляя при этом достоверной разницы по указанному параметру от коммерческого препарата "Recormon".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Гемостимулирующие свойства таблетированной формы рекомбинантного эритропоэтина человека в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.

2. Патент РФ 2128517. Стабилизированный водный раствор эритропоэтина. 6 А 61 К 38/22, 9/08. 10.04.99. Бюл. 10.

3. Патент РФ 2043118. Способ получения инъекционной формы эритропоэтина. 6 А 61 К 38/22. 10.09.95 Бюл. 25.

4. Steele P.M.R., Davies J.D., Greave J.Hyg., Camb. 1969, 67, 104-114.

5. Заявка РФ 97108814 от 22.05.97.

6. Shalaev E.Y., Varaksin N.A., Rjabicheva T.G., Cryo Letters, 1996, v. l7, 183-194.

Изобретение относится к фармакологии и медицине, а именно к получению таблетированного стабильного препарата рекомбинантного эритропоэтина, который может быть использован для лечения различных анемических состояний. Таблетированная форма рекомбинатного человеческого эритропоэтина для перорального применения содержит фосфатно-солевой буфер, сахарозу, желатозу, пептон, лактозу, стеарат кальция, эритропоэтин. Таблетка покрыта кислотоустойчивой оболочкой, в качестве которой используют ацетилфталилцеллюлозу. Техническим результатом является создание стабильной и безопасной пероральной формы эритропоэтина, сохраняющей специфическую активность в экспериментах, а также при длительном хранении. 3 табл.

Таблетированная форма рекомбинантного эритропоэтина для перорального применения, включающая кислотоустойчивую оболочку, в качестве которой используют ацетилфталилцеллюлозу, и ядро, содержащее очищенную субстанцию эритропоэтина в дозе 100-2000ЕД на таблетку, фосфатно-солевой буфер; стабилизаторы: сахарозу, желатозу, пептон; наполнители: лактозу, стеарат кальция в соотношении, мас. %:
Фосфатно-солевой буфер 0,025М - 25 - 50
Желатоза - 2 - 7
Сахароза - 2 - 7
Пептон мясной - 3 - 7
Стеарат кальция - 1
Лактоза - Остальное до 100
Эритропоэтин в дозе - 100 - 2000Ед