Цистеинсодержащие пептиды для синтеза пептидных гормонов окситоцина и вазопрессина Советский патент 1976 года по МПК C07C103/52 

этилового эфира тирозина и 2,2 м ;|ль) N -метилморфолина в 30 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при -1О С в течение 3 час и при комнатной тс ..г.оратуре 1 час. Затем продукт реакции осаждают водой, экстрагируют этилацететом, промьюают последовательно 0,О5 н. раствором серной кислоты, водой; 0,5 н. раство - ром бикарбоната натрия и водой. После высушивания органического слоя над безвод - ным сульфатом натрия, растворитель упаривают в вакууме. Полученное бесцветное масло кристаллизуют из смеси этилового спирта и гексана. Выход 9,3 г (85,2%), т. пл. 73-75 С, -21 (с-0,5, этиловы спирт). Найдено,%; С 59,40; Н 6,57; N7,52. Выделено, %:С 59,43; Н 6,47; Ы П ;- им е р 2. ВОС- S -бензамидоме- гл;т.ш1стеинил-тирозин (П). К 2.72г (5ммоль) этилового эфира ВОС - S -бензамидометил-цистеинил-тирозина прибавляют 20 мл 0,5н. раствора едкого натра я перемешивают цри комнатной температуре 50 мин. Затем реакционную смесь фильтруют, фильтрат при охлаждении (ОС) подкисляют 0,5н. соляной кислотой. Выпавший оса док отфильтровьюают, промьюают водой и кристаллизуют из смеси метанола и воды. Получают 1,8 г (65,2%) продукта, т. пл. 82-84°С, 20Q Lot-J-p--12 (с-О,2, этиловый спирт), содержание основного вещества 99,5%. Найдено, %: С 54,50; Н 6,11; N 7,58 N, S X Вычислено,%: С 54,24} Н 6,37; N7,59 П р и м е р 3. Метиловый эфир ВОС-аспарагинил- S -бензамидометил-шсстеина к охлажденному до -15 С раствору 3,7 (16 ммоль) ВОС-аспарагина в 1О мя диметилформамида прибавляют при перемешивании 1,76 мл (16 ммоль) N -метилморфолина W затем 1,8 мл (15 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через Ю мин добавляют охлажденную до -10 С смесь 3,04 г (10 ммоль) гидрохлорида метилового эфира S -бензамидометил-цистеина и 1,1 М -метил: юрфолина в 30 мл диметилформа -тпа. Смесь перемешивают 3 час при -15°С Затем реакционную смесь гидролизуют пр О С насыщенным раствором бикарбоната нат рия при рН 8 в течение 1 час. Продукт fibjцеляют прибавлением 1 50 мл воды, фильтрую промывают водой. После перекристаллизашш КЗ эиегэпа подучают 4 г (83%) вещест а, т. пл. 173-175°С, С°-Зд -39,2° (с-1,0, диметилформамид). Найдено, %: С 52,14; Н 6,36; N 11,58. Sl 30%°7 Вы шслено, %: С 52,27; Н 6,27; Ь 11,61. П р и м е р 4. Метиловый эфир ВОСгпутаминил-аспарагинип- 9 -бензамидометил-цистеина (IVV 4,83 (10 ммоль) метилового эфира ВОСаспарагинил- -бензамидометил-хшстеина обрабатьшают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) в течение 50 мин. Затем раствор упаривают в вакууме при комнатной температуре и к остатку прибавляют абсолютньй эфир. Полученный осадок фильтруют и высушивают в вакуум-эксикаторе над едким кали. Получают 4,57 г (92%) трифторацетата метилового эфира аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина. К охлажденному до О С раствору полученного трифторацетата в 45 мл диметилформамида прибавляют 1 мл (9,2 ммоль) N -метилморфолина, 3,4 г (9,2 ммоль) пнитрофенилового эфира ВОС-глутамина и перемешивают при комнатной температуре 48 час. Затем продукт осаждают эфиром, осадок фильтруют и промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н. раствором бикарбоната натрия, во дои. Продукт перекристаллизовьюают из смеси диметилформамида и эфира. Выход 4,4г (80%), т. пл. 175-176°С, ,1 (с-0,2, диметилформамид). Найдено,%: С 50,98; Н 6,32; N13,66. 6 Вычислено,%: С 51,14; Н 6,27; N13,76. П р и м е р 5, Метиловый эфир ВОС-изолейцил-глутаминип-аспарагинип- S-бензамидометил-цистеина6,4 г (10,5 ммоль) ВОС-глутаминиласпарагинил- S -беизамидометил-пистеина обрабатьтают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 6,25г (96%) трифторацетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- S -бёнзамидометия- цистеина. К охлажденному до -15 С раствору3,84г (16 ммоль) ВОС-изолейцина в 40 мл ди метилформамида прибавляют 1,76 мл (1.6 ммоль) N -метилморфолина и затем 1,8 мл (15 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную до -10°С смесь 6,25 г (10 ммоль) полученного грифторацетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- S -бензамидо метил-цистеша и 1,1 мл (10 ммоль) N -метипморфолина в 40 мл димeтIIлфopмa fflдa и перемешивают при -1 5 С Б течение 2 ч&с Обработкой реакционной смеси аналогично примеру 3 и перекристаллизацией из смеси диметилформамнда и эфира получают 5,9г (81,5%) продукта, т. пл. 210-211°С, -30 с-0,2, диметилформамид). Найдено, %: С 53,09; Н 7,00; N 13,57, S2 49°10 Вычислено, %: С 53,10; Н 6, 82; N13,55 Прим ер 6, Метиловьш эфир ВОС-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- & -бен замидометил-цистеина (VI). 6,4г (10,5ммоль) ВОС-глутаминил-аопарагинил- S -бензамидометил-цистеина обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 6,25 г (96%) трифторапетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- 5 -бензамидометил-цистеина, К охлажденному до -15 С раствору 4,3 (16 ммоль) ВОС-фенилаланина в 40 мл диметилформамида прибавляют 1,76 мл (16 ммоль) N -метилморфолина и затем 1,8 мл (15 ммоль) изобутилового эфира хлоругольной кислоты. Через 10 мин добавляют охлажденную до -10 С смесь 6,25 г (10 ммоль) полученного трифторацетата метилового эфира глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-пистеина с 1,1 мл (10 ммоль) N -метилморфолина в 40 мл диметилформамида и перемешивают при -15 С в течение 2 час. Обработкой реакционной смеси аналогично примеру 3 и перекристаллизацией из сме си диметилформамида и ацетона получают 6Д г (80,4%) продукта, т. пл, 186-187°С -17,5 с-0,3, диметилформамид). Найдено, %: С 55,35; Н 6,20; . N 12,79 Вычислено,%: С 55,47; Н 6,25; N . П р и е р 7. Метиловый эфир ВОС- S -бонзами д ом етил-цист еинил-тир ози л- изол ейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидом етил-цистеина (УП). 2,3 г (3,2 ммоль) ВОС-изолейцил-глутаминил-аспарагинил- Ь -бензамидометил- цистеина обрабатывают раствором трифторук сусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 2,2 г (94%) трифторацетата метилового эфира изолейцил-глутаминил-аспарагинил- 5 -бензамидометил-цистеина. К охлажденному до -15 С раствору 1,65 (3 ммоль) ВОС- S - бензамидометил-цист инил-тирозина в 15 мл диметилформамида рибавляют при перемешивании 0,33 мл (3 моль) N-метилморфолина и затем 0,36мл 3 ммоль) изобутилового эфира хлоруголь- кислоты. Через 12 мин добавляют ох ой-10 С смесь полученного вьь ажденную до е трифтсранетата 2,2 г (3 ммопь) и ,33 мл N -метилморфолина в 25 мл диметил- ормамида, смесь перемешивают при -15 С течение 3 час и затем продукт реакщп-; саждают водой при О С, фильтруют и проьтают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н. раствором бикарбоната натрия и водой. Продутст перекристаплизовывают из смеси диметилформамида и эфира. Выход 2,6 г (77%),-т. пл, 212-213°С, -22° с -0,1, диметилформамид). Найдено, %: С 55,32; Н 6,40; N 12,43. S2 70 14VoS Выделено, %: С 55,60; Н 6,28; N 12,47. П р и м е р 8. /Метиловый эфир ВОС-S-бeнзaмидoмeтил-ш cтeинил-TIфoзил-фeнилaлaнил-глyтaминил-f cпapaгинил- S -бензамидом етип-цистеина (VIII). 2,4 г (3,2 ммоль) ВОС-фенилаланилгпутаминкл-аспарагинил- S -бензамидометилцистеина обрабатьшают раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (1:1) по методике, описанной в примере 4. Получают 2,3 г (96%) трифторацетата метилового эфира фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- & - -бензами домети л-цнстеина. К охлажденному до -15 С раствору 1,65г (3 ммоль) ВОС- S -бензамидометил-цисте- инил-тирозина в 1 5 мл диметилформамида прибавляют при перемешивании 0,33 мп (3 ммопь) Н-мосттг1морфояина и затем 0,36 (3 ммоль) изобутилового эфира хлоруголь- ной кислоты. Через 15 мин добавляют охлажденную до -10 С смесь выше полученного трифторацетата 2,3 г (3 ммоль) и 0,33мл N -метилморфолина в 25 мл диметилформамида. Смесь перемеи-ивают при -15 С в течение 3 час. Затем продукт реакции осаждают водой при О С, фильтруют и промывают последовательно 0,05 н. раствором серной кислоты, водой, 0,5 н, раствором бикарбоната натрия и водой. Продукт перекристаллизовьюают из смеси диметилформамида и эф1фа. Выход 2,8г (80,7%), т. пл, 220-222 -21° С -0,2, диметилформамид). N 12,14, Найдено,%: С 56,92; Н 6,02; 5%8°14%0 2 Вычислено,%: С 57,10; Н 5,92; N12,10. П р и м е р 9. ВОС-S-бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил -глутаминил- -аспарагинил- S -бензамидометил-цистеин (fX). К 2,2 г (2 ммоль) метилового эфира ВОС- S -бензамидометил-цистеинип-тироэил изолейшш-глутаминил-аспараганилг- S р-бензамидометил-цистеина прибавлякхг 2,64 мл 1,5 н. раствора едкого натра и 5,3 мл fiHoK сана и перемешивают при комнатной температуре 1 час. Затем реакционную смесь фил труют, и фильтрат при О С подкисляют 0,5н серной кислотой. Выпавший осадок отфиль - тровьгоают, промывают водой и перекристал- лизовьюают из метилового спирта. Выход 1,5 (65%), т. пл. 198-200°С, -16 {с-0,1, диметилформамид), содержание основного вещества 99,5% (потенциометри- ческим титрованием). Найдено, %: С 52,63; Н 6,58; N 12,24 вычислено,%: С 52,54; Н 6,41; N12,04. Вещества 1-Y, YII, IX используют в син тезе окс.итоцина. Реакция проходит по следующей схеме: Гидролизом I получают П, ступенчатой конденсацией из Ш получают IV, потом из 1V-.V, конденсацией 11 с Y получают(:У11, из которого последующим гидролизом получают IX. Методом смешанных ангидридов с использованием изобутилового эфира хдоруголь ной кислоты в присутствии N -метилморфолина в качестве основания из IX получают нонапептидамид W -трет.-бутоксикарбонил-5 -бензамидометил-цистеинил-тирозил-изо лейцил-глутаминил-аспарагинил- 9 -бензами дометил-хшстеинил-пролйл-лейцилглицина, отщеплением от которого Ь - бензамидом&тильных защитных групп с одновременным замыканном дисульфидного цикла получают ВОС-окситошш. После отщепления ВОС-гру пы образуется окситоцин, П р и м е р 1О. Получение окситоцина. Стадия Г. Получение нонапептидаамида Ы -трет бутоксикарбонил- S -бензамидоме тил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутами - НИЛ-аспарагиния- Ь -бензамидометил-цистеинил-пролил-л ейцилглицина. Конденсацией эквимолярных количеств 1Х и амида пролиллейцилглицина методом смешанных ангидридов с использованием из бутилового эфира хлоругольной кислоты в присутствии N -метилморфолина в качестве основания при темпера уре -15 С получаю нонапептидамид-N -трет бутоксикарбонил- 6 -бензамидометил-ш1стеинил-т1фозип-изо лейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бензам дометил-цистеинил-пролил-лейцилглииина. К охлажденному до -15 С раствору 0,42 г (0,37 ммоль) ВОС- -бензамидоетил-цистеинил-тир озил-изолейцил-1лутами- ил-аспарагинил- 6 -бензамидометил-цистена (IX) в 5 мл диметилформамида прибавтот 0,04 мл (0,36 ммоль) N -метилморолина и затем 0,043 мл (0,36 ммоль) изоутилового эф1фа хлор угольной кислоты. Чеез 12 мин добавляют охлажденную смесь 0,105 г (0,36 ммоль) амида пролил-лейцйлглицинаи 0,04 мл (0,36 ммоль) N -метилморфолина в 5 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при -15 С в течение 3 час. Затем продукт осаждают водой при О С, фильтруют и промьшают последовательно 0,О5 н. раствором серной кислоты, водой, 0,25 н. раствором бикарбоната натрия и воПродукт перекристаш изуют из смеси диметилформамида и эфира. Выход О,4 г (72%)т. пл. 207-209°С, 6° (с-0,1, диметилформамид). Найдено,%: С 50,00; Н 6,58; N12,52 Вычислено,%: С 50,58; Н 7,00; N 12,90. Стадия II. Получение ВОС-окситоцина. Отщеплением S -бензамидометильных защитных групп от нонапептидаамида N - трет.-бутоксикарбонил- S -бензамидометил-цистеинил-тирозил-изолейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеинил- пролил-лейцилглицина с одновременным замьь канием дисульфидного цикла йодом в смеси метанола и диметилформамида получают ВОС- окситоцин. К раствору 0,36 г (1,5 ммоль) йода в 40 мл диметт лформамида и 4О, мл,метанола прикапывают при- температуре 25 С в течение 2 час раствор 0,44 г (0,3 ммоль) нонапептидаамида N -трё1 -бутоксикарбонил-S -бен замид ом етил-цистеинил-тиро зил- изолейцил-глутаминил-аспарагинил- S -бенза- мидометил-цистеинил-щэолил-лейцилглицина в 40 мл диметилформамида и 16 мл мета° реакционную перемешивают еще 4 час. После охлаждения смеси до О С осторожно прибавляют О,1 н. раствор тиосернокислого натрия до слабЬ -желтой окраски, упаривают в вакууме при температуре 30 С до маслянистого остатка. Остаток кристаллизуют добавлением эф1фа, фильтруют и высушивают в вакуум-эксикаторе над едким кали. После перекристаллизации из изо- пропилового спирта и эфира получают О,25г (10°)2о ОС-%ситоцина, т. пл. 168-172°С, -Q-- (с-0,5, этиловый сшфт). Найдено, %: С 47,92; Н 6,72; N 13,85 S20l4 2 6H20 Вычислено, %: С 47,43; Н 7,13; N13,54.

9 Стадия II. Получение окситоцина. Для получения биологически активного эптида-окситоиина, действием 90%-ной рифторуксусной кислоты от ВОС-окситоциа отщепляют ВОС-группу. 24 мл (0,02 ммоль) ВОС-окситоцина обабатывают 4 мл 90%-ной трифторуксусной 1СЛОТЫ при комнатной температуре в течете 40 мин. Фильтруют, к полученному рас-рэру прибавляют 80 мл воды и упаривают вакууме при 30 С. Затем прибавляют еще О мл воды и лиофилизуют. Получают 14,7м 70%) окситоцина. в° -22° (с-О,, М уксусная кислота). Описанным способом без предварительной шстки получен биологически активный пре|рат окситоцина с активностью 20 М. Е./мг По литературным данным лиофилизованный )епарат окситоцина обладает следующей ак- 1вностью: каталог фирмы .5 ig то. США, 971-15 М.Е./мг, каталог фирмы Serva РГ. 1972-10 М. Е./ мг, каталог фирмы ;a&bLOch.em , США, 1972-10 М. Е./мг. Вещества I-IY, YI и VIU используют в гатезе вазопрессина. Реакции проходят по leдующей схеме. Гидролизом I получают II, ступенчатой шденсацией из Ш получают IV, потом из V-YI, конденсацией II с VI получают VIII 3 которого последующим гидролизом полу1ЮТ ВОС- S -бензамидометил-цистеинил- гирозип-фенипаланип-гпутаминип-аспарагинил S -бензамидометил-цистеин. Прим ер 11. Получение вазопрессина. Конденсацией эквимолярных количеств ЭС- & -бензамидометил-цистеинил-тирозил-

10 енилаланил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеина и амида пролиларгинил- глицина методом смешанных ангидридов с использованием изобутилового эфира хлор- угольной кислоты в присутствии N -метилморфолина в качестве основания при температуре -15 С можно получить нонапептидамид ВО С- & -бензамидометил-цистеинилтирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- S -бензамидометил-цистеинил-пролиларги- нилглицина. Одновременным отщеплением S -бензамидометильных защитных групп и замыканием дисульфидного цикла получают ВОС-вазопрессин, из которого отщеплением ВОС-группы 90%-ной трифторуксусной кислотой получают вазопрессин. Формула изобретения Шстеинсодержащие пептиды общей форму ьМCH,NHCO-r Ш. (CHj)jC-0-COCy5 -Tyr-R-gln-Asa-Cys-Y где R - Не или Phe) У - ОСНд или ОН. (СНз)з С-О-СО (ВОС), СОШСНгЧЬгтл) в качестве промежуточных продуктов для синтеза пептидных гормонов окситоцина и вазо- прессина.