АКТИВАТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/99 C12N9/88 C07D257/12 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных производных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I

где
R¹=H и R²=NO₂ или R¹= NO₂ и R²=H или NO₂,
в качестве активаторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2. ; гунозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата (цГМФ) - универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1].

ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что рГЦ является основной мишенью фармакологического действия наиболее распространенных нитровазодилятаторов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия) и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Показано, что лечебный эффект вышеуказанных фармпрепаратов связан со стимуляцией активности рГЦ в результате взаимодействия оксида азота, образующегося при их биотрансформации, с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем.

Существенным недостатком известных вазодилятаторов на основе органических нитратов является возникновение толерантности при их длительном применении. В связи с этим, изучение молекулярного механизма регуляции активности рГЦ с помощью новых соединений, способных генерировать NO в живом организме и/или вызывать активацию фермента NO-независимым путем, является перспективным подходом для потока и создания новых более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов.

Известны нитрозамещенные фуроксаны, в частности, 3-нитро-4-фенил- и 4-нитро-3-фенил-1,2,5-оксадиазол-2-оксиды вышеуказанной общей формулы II

где
R¹=C₆H₅ и R²=NO₂ или R¹-NO₂ и R²=C₆H₅,
соответственно, в качестве активаторов рГЦ [2].

Однако данные соединения оказывали активирующее действие на фермент в специально подобранных условиях в присутствии высоких концентраций L-цистеина (5 mM). При более низких концентрациях L-цистеина влияние вышеуказанных соединений на активность рГЦ исследовалось. Кроме того, нитрофуроксаны обладают высокой реакционноспособностью по отношению к различным нуклеофильным реагентам [3], что затрудняет их применение в биохимических исследованиях.

Известен 4-нитрохинолин-1-оксид, оказывающий активирующее действие на рГЦ [4] . . Недостатком данного соединения является проявление активирующих свойств при высокой концентрации (5 mM).

Наиболее близкими к производным бензотетразин-1,3-диоксида вышеуказанной общей формулы I являются 3,5-дизамещенные пиразол-3-он-1,2-диоксиды общей формулы III

где
R - алкил(CH₃), арил (C₆H₅),
замещенный арил и др., являющиеся тиолзависимыми донорами NO и активаторами рГЦ[5].

Недостатками данных соединений, в частности, 3,5-дифенилпиразол-3-он-1,2-диоксида, являются невысокая степень активации рГЦ (в 2,5 раза в концентрации 10 мкМ, см. пример 1).

В литературе описаны производные бензотетразин-1,3-диоксида вышеуказанной общей формулы I [6]. Биохимические свойства данных соединений, в частности, влияние на активность рГЦ, не изучены.

Задачей настоящего является выявление нового активатора рГЦ с повышенной активирующей способностью.

Поставленная задача достигается применением известных производных бензотетразин-1,3-диоксида вышеуказанной общей формулы I, где R¹=H и R²=NO₂ или R¹=NO₂ и R²=H или NO₂, в качестве активаторов рГЦ.

Соединения общей формулы I были получены известным способом - нитрованием бензотетразин-1,3-диоксида азотной кислотой в среде серной кислоты или 20%-ного олеума [6].

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Активирующее действие производных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I на рГЦ.

Препарат рГЦ получали из тромбоцитов человека, выделенных из венозной крови доноров известным способом. Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ иммуноферментным способом с использованием наборов реактивов для количественного определения цГМФ АО "Биоиммуноген" (Россия).

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 150 мкл) приготавливалась при 0 - 4^oC и содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ креатинфосфат, 100 мкг (50 ед/мг) креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин, ферментный препарат (супернатант 105000 g, 10 - 20 мкг белка). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в виде раствора в водном диметилсульфоксиде (DMCO). Концентрация соединения в пробе составляла 1•10^-5 М, DMCO - 0,02% об. Контрольная проба показала отсутствие влияния DMCO в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в водяном термостате при 37^oC в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню с последующим охлаждением в ледяной бане. После отделения денатурированного белка центрифугированием (10 минут при 1500 g) в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося цГМФ вышеуказанным способом.

Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Активирующее действие соединений общей формулы I в концентрации 1•10^-5 М оценивали в сравнении с аналогичным эффектом наиболее близкого по структуре известного активатора рГЦ-3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксида. Степень активации рГЦ в вышеописанных условиях для 5-нитробензотетразин-1,3-диоксида составила 510%, для 7-нитробензотетразин-1,3-диоксида - 1750%, для 5,7-динитробензотетразин-1,3-диоксида - 650% (ср. для известного активатора 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксида - 250%).

Сравнение вышеприведенных данных позволяет сделать вывод о том, что производные бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I оказывают активирующее действие на рГЦ более выраженное, чем эффект прототипа. Таким образом, применение указанных соединений в биохимии расширяет ассортимент специфических регуляторов активности рГЦ.

Источники информации
1. Murad, F. "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system" Adv. Pharmacol. 1994, v. 26, p. 19 - 33.

2. Ferioli R., Folco G.C. et al. "A new class of furoxan derivatives as NO donors: mechanism of action and biological activity" Brit. J. Pharmacol. 1995, v. 114, p. 816 - 820.

3. Л.И.Хмельницкий, С.С.Новикова, Т.И.Годовикова. Химия фуроксанов. Реакции и применение, М.: Наука, 1996, с. 303.

4. P. A. Craven, F. R. DeRubertis "Inhibition by retinol and butylated hydroxyanisole of carcinogen-mediated increases in guanylate cyclase activitu and guanosine 3:5 - monophosphate accumulation" Cancer Res. 1977, v. 37, p. 4088 - 4097.

5. Выложенная заявка ФРГ N 422545, кл. C 07 D 231/18, оп. 1995 - прототип.

6. Churakov, A.M., Ioffe, S.L., Tartakovskii, V.A. "The first synthesis of 1,2,3,4-tetrazine-1,3-di-N-oxides" Mend. Commun., 1991, p. 101 - 103.

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано для изучения механизма регуляции растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ). Сущность изобретения заключается в применении производных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I, где R¹=Н и R²=NO₂ или R²=H или NO₂, в качестве активаторов растворимой формулы гуанилатциклазы (рГЦ). Производные бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I оказывают активирующее действие на рГЦ, более выраженное, чем эффект прототипа. Таким образом, применение указанных соединений в биохимии расширяет ассортимент специфических регуляторов активности рГЦ.

Применение производных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I

где R¹ = H и R² = NO₂ или R¹ = NO₂ и R² = H или NO₂
в качестве активаторов растворимой формы гуанилатциклазы.