АКТИВАТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/99 C12N9/88 C07D231/10 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению 4,4-дигалоидпроизводных 3,5-дизамещенных пиразол-1,2-диоксидов общей формулы I:

где
R¹ и R² - метил или фенил;
R³ - атом хлора или брома,
в качестве активаторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Вышеуказанные соединения могут найти использование в биохимии для изучения механизма регуляции рГЦ и других ферментов.

Гуанилатциклаза/КФ 4.6.1.2. ; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата(цГМФ)- универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1].

ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что в рГЦ является основной мишенью фармакологического действия наиболее распространенных нитровазодилятаторов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия) и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Показано, что лечебный эффект вышеуказанных фармпрепаратов связан со стимуляцией активности рГЦ в результате взаимодействия оксида азота, образующегося при их биотрансформации, с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем.

Существенным недостатком известных вазодилятаторов на основе органических нитратов является возникновение толерантности при их длительном применении. В связи с этим изучение молекулярного механизма регуляции активности рГЦ с помощью новых соединений, способных генерировать NO в живом организме и/или вызывать активацию фермента NO-независимым путем, является перспективным подходом для поиска и создания новых более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов.

Известен 3-фенил-4-хлор-1,2,5-оксадиазол-2-оксид, вызывающий активацию рГЦ в присутствии цистеина, используемого в концентрации 5 мМ [2].

Недостатком данного соединения является его низкое активирующее действие на рГЦ (в концентрации 5•10^-4 М оно активирует фермент ≈ в 2,3 раза).

Наиболее близкими к описываемым являются известные соединения - 3,5-дизамещенные пиразол-4-он-1,2-диоксиды, в частности 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксид(см. вышеуказанную формулу I, где R¹=R²-фенил и R³ + R³ = 0)[3]). Данное соединение является тиол-зависимым донором оксида азота и активатором рГЦ.

Недостатком данного соединения является сравнительно невысокая степень активации рГЦ.

Целью описываемого изобретения является поиск соединений в ряду известных замещенных пиразол-1,2-диоксидов, более эффективно активирующих рГЦ.

Указанная цель достигается применением известных 4,4-дигалоидпроизводных 3,5-дизамещенных пиразол-1,2-диоксидов вышеуказанной общей формулы I, где R¹, R² и R³ имеют вышеуказанные значения, в качестве активаторов рГЦ.

Данные соединения были получены известным способом при взаимодействии соответствующих 3,5-дизамещенных 1-гидроксипиразол-2-оксидов или диоксимов β-дикетонов с N-бром- или N- хлорсукцинимидом или N-бромацетамидом в водно-органической или водной среде при охлаждении [4].

Действие описываемых соединений на рГЦ до настоящего времени не исследовалось.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Активирующее действие производных пиразол-1,2-диоксида на рГЦ.

Препарат рГЦ получали из тромбоцитов человека, выделенных из венозной крови доноров известным способом. Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ иммуноферментным способом с использованием наборов реактивов для количественного определения цГМФ АО "Биоиммуноген" (Россия).

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 150 мкл) приготавливалась при 0-4^oC и содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6),1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ креатинфосфат, 100 мкг (50 ед/мг) креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин, ферментный препарат (супернатант 105000 g, 10-20 мкг белка). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в виде раствора в водном диметилсульфоксиде (DMCO). Концентрация соединения в пробе составляла 1•10^-5 M, DMCO - 0,02 об.%. Контрольная проба показала отсутствие влияния DMCO в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в водяном термостате при 37^oC в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню с последующим охлаждением в ледяной бане. После отделения денатурированного белка центрифугированием (10 минут при 1500g) в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося цГМФ вышеуказанным способом.

Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Эффективность активирующего действия изучаемых соединений в концентрации 1•10^-5 M оценивали в сравнении с аналогичным эффектом наиболее близкого известного соединения - 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксида (соединение I). Степень активации рГЦ в вышеуказанных условиях для соединений данного изобретения находилась в интервале 280-500%. В частности, для 3,5-дифенил-4,4-дихлорпиразол-1,2-диоксида она составила 380% (ср.250% для соединения I).

Пример 2. Генерация оксида азота производными пиразол-1,2-диоксида. Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по окрашенному продукту реакции азосочетания [5] с помощью спектрофотометра. Проба конечным объемом 400 мкл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4) 1 мМ цистеин, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% DMCO. В качестве отрицательного контроля использовался водный раствор DMCO в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ раствор нитрата натрия, содержащий 0,2% DMCO. Пробы инкубировали 1 час при 20^oC и добавляли последовательно 50 мкл 3 M раствора ацетата натрия, 300 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 300 мкл N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 минут и измеряли оптическую плотность при длин волны 554 нм на спектрофотометре.

3,5-Дифенил-4,4-дихлорпиразол-1,2-диоксид в вышеуказанных условиях генерировал 0,081 моль нитрита на моль соединения (в отсутствие цистеина образования нитрата не происходит). Известное соединение I в вышеуказанных условиях генерировало 0,053 моль нитрита на моль соединения.

Как вытекает из данных примера 1, соединения настоящего изобретения оказывают более выраженное активирующее действие на рГЦ и расширяют ассортимент специфических регуляторов активности данного фермента.

Изобретение относится к биохимии, может быть использовано для изучения механизма регуляции растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ). Сущность изобретения заключается в применении 4,4-дигалоидпроизводных 3,5-дизамещенных пиразол-1,2-диоксидов общей формулы I в качестве активаторов растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ). Степень активации рГЦ для соединений данного изобретения находилась в интервале 280 - 500%. В частности, для 3,5-дифенил-4,4-дихлорпиразол-1,2-диоксида она составила 380% (ср. 250% для известного соединения 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксида). Соединения настоящего изобретения оказывают более выраженное активирующее действие на рГЦ и расширяют ассортимент специфических регуляторов активности данного фермента. 1 з.п. ф-лы.

1. Применение 4,4-дигалоидпроизводных 3,5-дизамещенных пиразол-1,2-диоксидов общей формулы I

где R¹ и R² - метил или фенил;
R³ - атом хлора или брома,
в качестве активаторов растворимой формы гуанилатциклазы. 2. Применение соединения по п.1, где R¹ = R² - фенил, R³ - атом хлора.