ДОНОР ОКСИДА АЗОТА И АКТИВАТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/99 C12N9/88 C07D413/14 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению бензо[1,2-c: 3,4-c': 5,6-c''] трис[1,2,5] оксадиазол-1,4,7- триоксида (бензотрифуроксана) формулы I:

в качестве донора оксида азота и активатора растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Изобретение может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ и других NO-зависимых ферментов.

Гуанилатциклаза /КФ. 4.6.1.2. ; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата (цГМФ) - универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1].

ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что рГЦ является основной мишенью фармакологического действия наиболее распространенных нитровазодилятаторов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия) и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Показано, что лечебный эффект вышеуказанных фармпрепаратов связан со стимуляцией активности рГЦ в результате взаимодействия оксида азота, образующегося при их биотрансформации, с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем.

Существенным недостатком известных вазодилятаторов на основе органических нитратов является возникновение толерантности при их длительном применении. В связи с этим, изучение молекулярного механизма регуляции активности рГЦ с помощью новых соединений, способных генерировать NO в живом организме и/или вызывать активацию фермента NO-независимым путем, является перспективным подходом для поиска и создания новых более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов.

Известны различные N-оксиды и близкие к ним по строению соединения, являющиеся донорами оксида азота и/или его биологически активных форм (восстановленной формы - NO^-/HNO, нитрозотиолов), активаторами рГЦ и оказывающие фармакологическое действие на сердечно-сосудистую систему [2].

Так, известны 3,4-дизамещенные фуроксаны, в частности, 1,2,5-оксадиазол-3,4-динитрил-2-оксид, 3-фенил-1,2,5-оксадиазол-4-нитрил-2-оксид и его изомер общей формулы II:

где R¹ = CN и R² = CN или C₆H₅ или R¹ - C₆G₅ и R² = CN, являющиеся донорами оксида азота и активирующие рГЦ из легких крысы в концентрации 0,5 мМ и в присутствии 5 мМ L-цистеина [3]. Действие данных соединений при более низких концентрациях не изучено.

Известны ациклические тримерные фуроксаны общей формулы III:

где R = CH₃, C₃H₇, CH₂OH, CH₂Cl, OC₂H₅, C₆H₅, OC₆H₅, в качестве доноров оксида азота и вазорелаксантов [4]. Однако действие данных соединений на рГЦ не изучено.

Целью описываемого изобретения является поиск нового донора азота и активатора рГЦ, обладающего более выраженными биохимическими свойствами.

Указанная цель достигается применением известного бензо[1,2-c:3,4-c': 5,6-c''] трис[1,2,5] оксадиазол-1,4,7-триоксида вышеуказанной формулы I в качестве донора оксида азота и активатора рГЦ.

Бензо[1,2-c: 3,4-c':5,6-c'']трис[1,2,5]оксадиазол-1,4,7-триоксид формулы I был получен известным способом, основанным на реакции 1,3,5-трихлор-2,4,6-тринитробензола с азидом натрия в среде диметилсульфоксида с последующей термоциклизацией промежуточного 1,3,5-трихлор-2,4,6-тринитробензола [8].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Генерация оксида азота из бензо[1,2-c: 3,4-c': 5,6-c''] трис[1,2,5]оксадиазол-1,4,7-триоксида вышеуказанной формулы I.

Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра.

Проба конечным объемом 400 мкл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4), 5 мМ глутатион, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% ДМСО. В качестве отрицательного контроля использовался водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ раствор нитрита натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 30 мин при 37^oC и добавляли последовательно 50 мкл 3 М раствора ацетата натрия, 300 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 300 мкл N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 минут и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.

Бензо[1,2-c:3,4-c':5,6-c'']трис[1,2,5]оксадиазол-1,4,7- триоксид формулы I в вышеуказанных условиях генерировал 0,755 моль нитрита на моль соединения (в отсутствии тиолов образования нитрита не происходит). Известный структурный аналог - бензо[1,2-c:3,4-c']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксид формулы IV в вышеуказанных условиях генерировал 0,237 моль нитрита на моль исходного соединения.

Пример 2. Активирующее действие бензо[1,2-c:3,4-c':5,6-c'']трис[1,2,5] оксадиазол-1,4,7-триоксида формулы I на рГЦ.

Препарат рГЦ получали из легких крысы известным способом. Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ известным радиоизотопным способом с использованием [α-³²P] ГТФ в качестве субстрата рГЦ.

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 100 мкл) содержали 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 5 мМ глутатион, 0,2 мМ ГТФ (200 000 имп/мин [α-³²P] ГТФ на пробу), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ креатинфосфат, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантил, 2 мМ цГМФ, ферментный препарат (супернатант 30 000 g, 20-40 мкг белка на пробу). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в виде раствора в водном диметилсульфоксиде (ДМСО). Концентрация соединения в пробе составляла 1•10^-5 М, ДМСО - 0,02% об. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в водяном термостате при 37^oC в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню. После соосаждения непрореагировавшего ГТФ под действием карбоната цинка и центрифугирования в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося [³²P] цГМФ вышеуказанным способом с использованием хроматографии на колонках с кислой окисью алюминия. Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали человеческий сывороточный альбумин.

Эффективность активирующего действия бензо[1,2-c: 3,4-c': 5,6-с''] трис[1,2,5] оксадиазол-1,4,7- триоксида формулы I в концентрации 10 мкМ при инкубации в присутствии или в отсутствии 5 мМ глутатиона оценивали в сравнении с аналогичным эффектом бензо[1,2-c:3,4-c']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6- диоксида формулы IV в концентрациях 10 и 100 мкМ. Степень активации рГЦ в вышеуказанных условиях для соединения данного изобретения составляла 21460% в присутствии 5 мМ глутатиона и 1280 раз в его отсутствие (ср. для известного аналога: в концентрации 100 мкМ - 8950% в присутствии 5 мМ глутатиона и в концентрации 10 мкМ - 294% в отсутствие глутатиона).

Как вытекает из данных примеров 1 и 2, соединение настоящего изобретения является более эффективным донором оксида азота и оказывает более выраженное активирующее действие на рГЦ, чем его структурный аналог. Таким образом применение бензо[1,2-c: 3,4-c': 5,6-c'']трис[1,2,5]оксадиазол-1,4,7- триоксида формулы I в биохимии расширяет ассортимент доноров оксида азота и специфических регуляторов активности рГЦ.

Источники информации
1. Murad, F. "Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal - transduction system" Adv. Pharmacol. 1994, v. 26, p. 19-33.

2. "Methods in nitric oxide research" Ed. Feelisch,. M., Stamler, J., J. Wiley & Sons, 1996, p. 71-118.

3. Ferioli R., Folco G.C. et al. "A new class of furoxan derivatives as NO donors: mechanism of action and biological activity" Brit. J. Pharmacol. 1995, v. 114, p. 816-820.

4. Gasco, A.M., Cena, C., et al. "Synthesis and structural characterization of the trimeric furoxan (=furazan-2-oxide) system, a new potent vasodilatory moiety". Helv. Chim. Acta, 1996, v. 79, p. 1803-1817.

8. Bailey, A.S. "An improvement in the preparation of bensotrifuroxan; further examples of complex formation by this reagent'. J. Chem. Soc., 1960, N 11, p. 4710-4712.

Изобретения относится к биохимии, в частности к применению бензо[1,2-с: 3,4-c':5,6-c"]триc[1,2,5]окcaдиазол-1,4,7-триоксида в качестве донора оксида азота и активатора растворимой формы гуанилатциклазы. Соединение является более эффективным донором оксида азота и оказывает более выраженное активирующее действие на рГЦ, чем его структурный аналог. Таким образом, применение бензо[1,2-c:3,4-c':5,6-c"]триc[l,2,5]оксадиазол-1,4,7-триоксида формулы I в биохимии расширяет ассортимент доноров оксида азота и специфических регуляторов активности рГЦ.

Применение бензо[1,2-с: 3,4-с^':5,6-с^'']трис[1,2,5]оксадиазол-1,4,7-триоксида формулы I

в качестве донора оксида азота и активатора растворимой формы гуанилатциклазы.