Способ определения розеткообразующей реакции нейтрофилов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофильных гранулоцитов (ГГ). с целью прогнозирования течение различных заболеваний бактериальной, вирусной и аллергической природы, мониторинга иммунного статуса при проведении иммуно- коррекции дисфункций НГ.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Подготовка клеток. Забор крови. Кровь получают из безымянного или указательного пальца. Кровь в объеме 0,5 мл самотеком набирают в, капилляр, смоченный 2,7%-ным

раствором ЭДТА. Кровь помещают в стеклянную центрифужную пробирку, смоченную ЭДТА той же концентрации из расчета 10:1.

Выделение лейкоцитарной взвеси.

Лейкоцитарную взвесь получают путем лизиса эритроцитов гемолитической жидкостью состава: 0,083%-ного раствора хлористого аммония +0.04 г/л ЭДТА рН 7,2-7,4. К оставшимся после центрифугирования клеткам крови добавляют 1 мл гемолитической жидкости на 30 с при постоянном помешивании. Затем добавляют 2++5 мл среды 199 для прекращения действия гемолитической жидкости на клетки. Центрифугируют 10 мин 1000 об/мин, сливают надосадочную жидкость, осадок осторожно встряхивают, К полученному осадку клеток

VI

СЛ 00 СЛ СЛ

о

добавляют среду 199 в количестве 0,3-0,4 мл. Ресуспендируют.

Постановка реакции роэеткообразова- ния.

Постановка рЕ-РОН. В лунку планшета наливают 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов, добавляют 0,05 мл 2,5%-ный суспензии эритроцитов барана ,{ЭБ) трижды отмытых физраствором. Инкубируют в течение 5 мин при 4°С. Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования в лунки осторожно, чтобы не взболтать осадок, добавляют 0,05 мл 0,6-1 %-ный раствор глута- ральдегида. Выдерживают при комнатной температуре 5-7 мин. После этого надоса- дочную жидкость удаляют одновременно из двух лунок планшета быстрым интенсивным встряхиванием. Затем в лунки заливают по 0,1 мл физраствора или среды 199. Осадок тщательно ресуспендируют и готовят препарат-каплю.

Постановка пЕ-РОН. В лунку планшета заливают 0,05 мл лейкоцитарной суспензии, добавляют 0,05 мл 2,5%-ной суспензии ЭБ. Планшет инкубируют 20 мин при 4 С. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. Далее следует повторная инкубация 60 мин при 4°С. Затем фиксируют 0,05 мл 0,6-1 %-ным раствором глута- ральдегида в течение 4-7 мин. Останавливают фиксацию интенсивным встряхиванием планшета. ДобавляютО,1 мл среды 199. ресуспендируют. Готовит препарат-каплю.

Подсчет розеткообразующих клеток. Высушенные мазки фиксируют в метаноле в течение 10 мин окрашивают раствором азур-зозин рН 6-6 (по Романовскому) в течение 5 мин. Ополаскивают водой, сушат на воздухе, подсчитывают количество ро- зеткообразующих нейтрофилов на 100 ней- трофилов.

Способ апробирован на 180 работниках Апшеронского деревообрабатывающего

комбината, которым проводился мониторинг иммунного статуса с целью выявления иммунопатологических состояний. При этом параллельно оценилось состояние здоровья

работающих и уточнялись клинические признаки иммунодефицита. Установлено, что у 15,46% рабочих имеется дефицит рЕ-РОИ, у 5,0% - поздних Е-РОН; гиперфункция НГ обнаружена по рЕ-РОН у 28.12 обследованныхлиц,попЕ-РОН-у 52,48%. Выяэленные дисфункции рецепторного аппарата в 87,5% случаев совпали с клинически выявленными признаками иммунопатологических состояний, которые выражались в

5 наличии хронической бактериальной инфекции, персистирующей вирусной инфекции (лица длительно и часто болеющие), аллергическими и аутоиммунными процессами. Преимущества предлагаемого способа

0 представлены в таблице.

Таким образом, имеется явное преимущество при использовании предлагаемого экспресс-микрометода при массовых эпидемиологических обследованиях и проведе5 нии мониторного иммунного статуса у лиц с вторичным ИДС, находящихся на иммуно- коррекции.

Формула изобретения Способ определения розеткообрззую0 щей реакции нейтрофилов, включающий выделение лейкоцитов из крови, инкубацию с эритроцитами барана, фиксацию глутаро- вым альдегидом, остановку фиксации и подсчет розеток в ранней и поздней

5 субпопуляциях нейтрофилов, отличающийся тем. что, с целью упрощения и ускорения способа, выделение лейкоцитов осуществляют с помощью гемолиза эритроцитов растворов хлористого аммония из

0 микрообъемов крови, инкубацию с эритроцитами барана ведут в лунках планшета, фиксируют 0,6-1 %-ным раствором глутаро- аого альдегида в течение 5-7 мин. далее удаляют фиксатор встряхиванием планше5 та.

Использование: предложенное изобретение относится к медицине и может быть использовано, в практике клинической иммунологии для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов по системе нейтрофиловых гранулоцитов (НТ). Цель - ускорение и упрощение способа. Сущностью предложения является экспресс- метод определения розеткообразующей способности НГ в капиллярной крови, при этом эритроциты разрушают гемолитической жидкостью, а отцентрифугированную взвесь помещают в лунку планшета, фиксируют 0,05 мл 0,6-1 % р-ра глутаральдегида в течение 5-7 мин, а затем фиксацию останавливают встряхиванием планшета, и в препарате-капле выявляют розеткообразующую способность НГ известным способом. 1 табл. Ј