СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Legionella pneumophila 1,3 И 6 СЕРОГРУПП (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК G01N33/569 G01N33/544 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике при идентификации патогенных бактериальных культур - возбудителя пневмоний человека Legionella pneumophila.

В настоящее время фирмами Оксоид (Англия), Биорад (США) и Микроген (Англия) выпускаются наборы латекс-диагностикумов, позволяющие в течение 2-3 мин выявлять в реакции на стекле все 14 серогрупп основного патогена L.pneumophila и ряд других видов этого возбудителя. Один препарат диагностикума выявляет 1 серогруппу L.pneumophila, другой - 2-14 группы суммарно. Наборы диагностикумов отличаются высокой активностью и специфичностью, Однако весьма дорогостоящи. Кроме того, в данных наборах отдельные серогруппы L.pneumophila, почти такие же практически важные, как и 1 серогруппа, - 3 и 6, остаются индивидуально вне досягаемости, последние чаще других серогрупп наиболее широко распространены во внешней среде и вызывают легионелез человека.

За прототип выбран способ изготовления легионеллезных латекс-диагностикумов для слайд-агглютинации (см. в работе Sedgwick А.а. Tilton R. Identification of L.pneumophila by latex agglutination // J. Clin. Microbiol. - 1983, - 17. - 2. - P.365-368) заключающийся в том, что из 10% полистирола (Dow Chemical Со, США ) изготавливают микросферы 0,8 мкм, нагрузку последних антителами осуществляли путем контакта их с разведенными иммунными сыворотками при 37°C в течение 2-х часов. Препараты разводили 1:20 глициновым буфером с 1% БСА, жидкость фильтровали от аггрегировавших частиц, с последующим использованием ее в реакции слайд-агглютинации ,учет результатов прводили через 2-3 мин и наблюдали в положительном случае бесцветный агглютинат клеточных взвесей, в отрицательном - взвесь оставалась равномерно мутной.

Однако, при достаточной активности и специфичности, известным диагностикумом невозможно выявлять по отдельности ряд эпидемически важных серогрупп, а именно 3 и 6-ю, возбудителя легионеллеза наиболее широко распространенных во внешней среде и чаще других серогрупп вызывающих пневмонию у человека.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке диагностикума для обнаружения возбудителя легионеллеза конкретной серогруппы, а именно 1, 3 и 6 с высокой специфичностью, демонстративностью и низкой себестоимостью.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в известном способе конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающем получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L. pneumophila в реакции слайд-агглютинации, и отличающимся тем что в качестве полимерного носителя антител используют полиакролеин, обработанный на стадии полимеризации сафранином Т, а микросферы выполняют диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных группы 0,4 мкмоль/г , затем носитель дополнительно обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°С в течении трех часов и выдерживают 15 часов при комнатной температуре, отмывают водой посредством центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl₃ , после этого проводят сенсибилизацию микросфер легионеллезной кроличьей сывороткой, для этого 25 мг носителя суспендировали в 0,9 мл физиологического раствора и добавляли 0,1 мл разведенной (1:40) сыворотки, полученную суспензию перемешивают в течение 2-х часов при комнатной температуре, затем 15 часов при 4°С отмывают раствором хлористого натрия и суспендируют их в 1 мл того же раствора с 1% желатозой, проводят консервацию полученного диагностикума и разливают его в 5 мл емкости для использования и хранения.

Кроме того для диагностикума 1 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (1),которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин., причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных ( латексных ) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агглютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.

При этом для диагностикума 3 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (3), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных (латексных) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агглютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы..

Кроме того для диагностикума 6 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (6), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600 , сенсибилизацию этих антител на полимерных ( латексных ) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агтлютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.

При этом реакцию слайд-агглютинации проводят на стекле, смешивая каплю исследуемого материала, в которую вносят микропипеткой (0,02-0,05) мкл одного из диагностикумов 1,3 или 6 серогруппы, помешивают в течение 1 мин и учитывают результат реакции как положительный по наличию ярко-красного агглютината с последующим просветлением жидкости, что подтверждает присутствие легионелл соответствующей серогруппы.

Способ осуществляется следующим образом. Для проведения способа в качестве полимерного носителя антител используют - полиакролеин, из которого получают полимеризацией в водно-щелочной среде в присутствии радикального инициатора микросферы диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных групп 0,4 мкмоль/ г.

При этом на стадии полимеризации добавляют сафронин Т, который окрашивает микросферы в красный цвет.

Для повышения сорбционной емкости микросферы обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°С в течение 3 часов, затем выдерживают 15 часов при комнатной температуре и отмывают водой с помощью центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl₃ .

Следующм этапом способа является приготовление кроличьих иммунных легионелезных сывороток. Иммунизацию животных проводят по общепринятой схеме ,а иммунизирующими препаратами взяты типовые культуры Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп. Легионелезные кроличьи сыворотки получают к прогретым клеткам легионел при 100°С в течение 20 мин. Прогреванием культур устраняют в них белковые и сохраняют нужные липополисахаридные антигены. Титры антител в получаемых сыворотках были не меньше 1:1600.

Сенсибилизация микросфер легионеллезными сыворотками осуществляют следующим образом: 25 мг носителя суспендируют в 0,9 мл физиологического раствора и добавляют 0,1 мл разведенной 1:40 сыворотки. Суспензию перемешивают в течение 2 - часов при комнатной температуре, затем 15 часов - при 4°С, отмывают физиологическим раствором и суспендируют их в 1 мл 0,9% хлористого натрия с 1% желатозы.

Для консервации препарата добавляют мертиолат (1:10000) и разливают в 5 мл пластиковые емкости (микропробирки) и хранят при температуре 6-8°С. Активность диагностикумов при сохранении их при температуре холодильника не снижалась в течение года. Методика постановки реакции.

Для постановки реакции слайд-агглютинации на стеклянное дно чашки Петри наносят каплю (25 мкл) 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Петлей, забирая из газона культуру, делают в ней взвесь плотностью около 10⁸-10⁹ м.к./мл и вносят микропипеткой (0,02-0,03) мкл взвеси диагностикума, распределяя его по капле. Далее стекло круговыми движениями покачивают в течение 1-3 мин, заставляя взвесь перемещаться. Результат реакции учитывают по наступающей в позитивном случае агглютинации микроба в капле. Микробные клетки агглютинируют в агрегат красного цвета, капля просветляется. При отрицательном результате взвесь клеток остается мутной красноватого цвета..

Разработанный набор латекс-диагностикумов для серогрупп - 1,3 и 6 - изготовлен в трех сериях и проверен как в экспериментальных лабораторных испытаниях, так при при полевых исследованиях различных водных обьектов внешней среды на легионеллы, а также при комиссионных испытаниях. Результаты испытаний видны из примеров 1, 2, 3.

Пример 1. Экспериментальные лабораторные испытания латекс-диагностикумов на 1, 3 и 6 серогруппы с типовыми штаммами L. pneumophila. Культуры легионелл выращивают на плотной легионеллезной питательной среде СЭЛ, созданной в Ростовском ПЧИ, в течение 2-х суток при 35°С, смывают калий-фосфатным буфером (рН - 7,1 ) и готовят исходную взвесь клеток плотностью 10⁸-10¹⁰ м.к./мл. Для реакции можно брать как живую взвесь культуры, так и автоклавированную при 121°С в течение 15 мин.

Проводят реакцию слайд-агглютинации . На стекло наносят каплю взвеси и вносят в нее маленькую капельку (0,02-0,03 мл) диагностикума. Взвесь перемешивают стеклянной палочкой или петлей в течение 1-2 мин и учитывают реакцию по образованию красного агглютината-положительный результат, который начинает образовываться на первой же минуте перемешивания и достигает максимума через 2 мин. Жидкость при этом просветляется. Отрицательный результат - капля остается равномерно красно-мутной без образования агглютината и просветления.

Параллельно для контроля проводили латекс-агглютинацию с диагностикумами на 1 и 2-14 серогруппы L. pneumophila фирмы Оксоид, а также для контроля культур - обычную агглютинацию на стекле с соответствующими серогрупповыми легионеллезными сыворотками в разведении 1:100.

Результаты данных испытаний представлены в таблице 1. Все три испытуемых диагностикума были специфичны и демонстративны четко выявляли штаммы собственной серогруппы (1, 3 и 6-й) и не реагировали со штаммами L. pneumophila других серогрупп.

Пример 2. Изучена специфичность предлагаемых диагностикумов в отношении свежевыделенных и коллекционных полевых штаммов L. pneumophila различных серогрупп.

Приготовление культур легионелл, постановка реакции слайд-агглютинации и контроли соответствуют описанным в примере 1. Результаты отражены в таблице 2 . Как видно, испытуемые диагностикумы отличались достаточно хорошей специфичностью и демонстративностью выявляя искомые серогруппы легионелл и не реагируя на гетерогенные серогруппы.

Пример 3. В этом испытании изучена специфичность диагностикумов в отношении гетерологичных видов микроорганизмов из коллекции Ростовского ПЧИ. Приготовление культур для реакции: штаммы холерных вибрионов выращивали на агаре Мартена, других видов - на агаре Хоттингера в течение 1 сут при 36°С. Плотность суспензий бактерий - 1 млрд м.к./мл. Постановка реакции слайд-агглютинации и контроли - так, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, все диагностикумы были специфичными и не реагировали на посторонние культуры. Высокоспецифичными были также и диагностикумы фирмы Оксоид.

Использование предполагаемого изобретения позволяет осуществлять конструирование диагностикумов для обнаружения возбудителя легионелеза конкретной серогруппы L.pneumophila, а именно 1, 3 и 6 .

При этом созданные латекс-диагностикумы для выявления в слайд-агглютинации 1, 3 и 6 серогрупп представляют собой специфичные диагностические препараты, которые не уступают международно признанному набору легионеллезных диагностикумов фирмы Оксоид. Достоинством набора диагностикумов Ростовского ПЧИ является четкость и демонстративность реакции, а также возможность выявлять по отдельности наиболее важные с точки зрения эпидемиологии легионеллеза 1, 3 и 6 серогруппы L. pneumophila. При этом набор в стоимостном отношении более дешев, чем выпускаемые указанными фирмами.

Таблица 1 сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзны латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» с гомологичными микроорганизмами Исследуемые штаммы Латекс - диагностикумы «Oxoid» серогруппы 1 3 6 1 2-14 L. pneumophila серогруппа 1 штамм Philadelphia АТСС 33152 + - - + - L. pneumophila серогруппа 2 штамм Togus АТСС 33154 - - - - + L. pneumophila серогруппа 3 штамм Blumington АТСС 33155 - + - - + L. pneumophila серогруппа 4 штамм Los-Angeles АТСС 33156 - - - - + L. pneumophila серогруппа 5 штамм Dallas АТСС 33216 - - - - + L. pneumophila серогруппа 6 штамм Chicago 2 АТСС 33215     + - + L. pneumophila серогруппа 7 штамм Chicago 8 АТСС 33823 - - - - +

Таблица 2 сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзных латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» со штаммами L. pneumophila, выделенными из объектов окружающей среды Исследуемые штаммы Латекс-диагностикумы Oxoid серогрупы 1 3 6 1 2-14 L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-2 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-3 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-4 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-5 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-6 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-7 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм 41 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм Р-1 + - - + - L. pneumophila серогруппы 1 штамм Р-3 + - - + - L. pneumophila серогруппы 2 штамм 33154         + L. pneumophila серогруппы 2 штамм 38 - - - - +

L. pneumophila серогруппы 2 штамм 39   - - - + L. pneumophila серогруппы 2 штамм 40 - - - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 33156 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм B-l-7 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм В-1-4 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм С-1-6 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 40к   +     + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 13 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 38к   +     + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 42 - + - - + L. pneumophila серогруппы 3 штамм 19 - + - - + L. pneumophila серогруппы 4 штамм 33156 - - - - + L. pneumophila серогруппы 4 штамм 13-1 - - - - + L. pneumophila серогруппы 4 штамм 15-1 - - - - + L. pneumophila - - - - +

серогруппы 4 штамм 5-4           L. pneumophila серогруппы 4 штамм 23-1 - - - - + L. pneumophila серогруппы 5 штамм 33216 - - - - + L. pneumophila серогруппы 5 штамм 42-1 - - - - + L. pneumophila серогруппы 5 штамм 99-1 -- - - - + L. pneumophila серогруппы 6 штамм 33215 - - + - + L. pneumophila серогруппы 6 штамм 22-3 - - + - + L. pneumophila серогруппы 6 штамм 5 - - + - + L. pneumophila серогруппы 7 штамм 16411 - - - - + L. pneumophila серогруппы 7 штамм 23-5 - - - - + L. pneumophila серогруппы 7 штамм 43-2 - - - - +

Таблица 3 сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзных латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» с гетерологичными микроорганизмами Исследуемые штаммы Латекс-диагностикумы «Oxoid» серогруппа 1 3 6 1 2-14 Y. pestis штамм 17691 - - - - - Y. pestis EV-76 линии НИИЭГ   - - - - F. tularensis штамм 240 - - - - - F. tularensis штамм 543 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 1 штамм 12659 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 2 штамм 14842 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 3 штамм 12310 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 4 штамм 1995 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 5 штамм 282 - - - - - Y. pseudotuberculosis серовар 6 штамм          

5504           Br.abortus штамм1151 - - - - - Br. melitensis штамм1150 - - - - - Br. suis штамм 1152 - - - - - Y. enterocolitica серовар 09 штамм 2131 - - - - - V. cholerae eltor штамм 9963 - - - - - E. coliATCC 25922 - - - - - Campylobacter jejuni штамм 457 - - - - - С. Diphtheriae gravis штамм «Тимаков» - - - - - Staphylococcus aureus - - - - - Streptococcus pneumonia - - - - - Klebsiella pneumonia - - - - - L. monocytogenes серогруппы 1 штамм 18875 - - - - - Salmonella typhimurium - - - - -

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и описывает способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающий получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L. pneumophila в реакции слайд-агглютинации, причем в качестве полимерного носителя антител используют полиакролеин, который на стадии полимеризации обрабатывают сафранином Т, а микросферы выполняют диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных групп 0,4 мкмоль/г, затем носитель дополнительно обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°C в течение трех часов и выдерживают 15 часов при комнатной температуре, отмывают водой посредством центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl₃, после этого проводят сенсибилизацию микросфер легионеллезной кроличьей сывороткой, для этого 25 мг носителя суспендировали в 0,9 мл физиологического раствора и добавляли 0,1 мл разведенной (1:40) сыворотки, полученную суспензию перемешивают в течение 2-х часов при комнатной температуре, затем 15 часов при 4°C отмывают раствором хлористого натрия и суспендируют их в 1 мл того же раствора с 1% желатозой, проводят консервацию полученного диагностикума и разливают его в 5 мл емкости для использования и хранения. Способ обеспечивает обнаружение возбудителя Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп с высокой специфичностью, демонстративностью и низкой себестоимостью. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 3 табл.

1. Способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающий получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L. pneumophila в реакции слайд-агглютинации, отличающийся тем, что в качестве полимерного носителя антител используют полиакролеин, который на стадии полимеризации обрабатывают сафранином Т, а микросферы выполняют диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных групп 0,4 мкмоль/г, затем носитель дополнительно обрабатывают 5%-ным водным раствором танина при 37-40°С в течение 3 ч и выдерживают 15 ч при комнатной температуре, отмывают водой посредством центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl₃, после этого проводят сенсибилизацию микросфер легионеллезной кроличьей сывороткой, для этого 25 мг носителя суспендировали в 0,9 мл физиологического раствора и добавляли 0,1 мл разведенной (1:40) сыворотки, полученную суспензию перемешивают в течение 2-х ч при комнатной температуре, затем 15 ч при 4°C отмывают раствором хлористого натрия и суспендируют их в 1 мл того же раствора с 1%-ной желатозой, проводят консервацию полученного диагностикума и разливают его в 5-миллиметровые емкости для использования и хранения.

2. Способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для L.pneumophila по п.1, отличающийся тем, что для диагностикума 1 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (1), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°C в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных (латексных) микросферах используют для выявления в реакции слайд- агглютинации клеток штаммов L.pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.

3. Способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для L.pneumophila по п.1, отличающийся тем, что для диагностикума 3 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (3), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°C в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных (латексных) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агглютинации клеток штаммов L.pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.

4. Способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для L.pneumophila по п.1, отличающийся тем, что для диагностикума 6 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (6), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°C в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных (латексных) микросферах используют для выявления в реакции слайд- агглютинации клеток штаммов L.pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.

5. Способ по любому из пп.2, 3 и 4, отличающийся тем, что реакцию слайд-агглютинации проводят на стекле, смешивая каплю исследуемого материала, в которую вносят микропипеткой (0,02-0,03) мкл одного из диагностикумов 1, 3 или 6 серогруппы, помешивают в течение 1 мин и учитывают результат реакции как положительный по наличию ярко-красного агглютината с последующим просветлением жидкости, что подтверждает присутствие легионелл соответствующей серогруппы.