НЕПРЕРЫВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ Российский патент 1999 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к непрерывному способу получения лимонной кислоты и ее солей, и может быть использовано в пищевой промышленности, медицине, фармакологии.

Известен способ производства лимонной кислоты путем культивирования гриба Aspergillus niger на мелассной питательной среде при непрерывном введении питательного раствора и удалении конечного продукта (а.с. СССР N 510509, C 12 P 7/48, 1976). В указанном способе обеспечивается невысокий прирост среднесуточной производительности по лимонной кислоте по сравнению с периодическим ведением процесса.

Известен способ получения лимонной кислоты и ее солей из ферментационных растворов, получаемых при культивировании дрожжей на углеводородных субстратах (а. с. СССР N 998504, C 12 P 7/48, 1983). Недостатком данного способа является ведение процесса ферментации в периодическом режиме, а также использование для производства солей лимонной кислоты (натрия или калия лимоннокислого) основных ферментационных растворов.

Наиболее близким к предложенному по своей технической сущности является непрерывный способ получения лимонной кислоты, включающий постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger на мелассной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, путем подачи необходимого количества питательной среды непрерывным потоком с последующим выделением лимонной кислоты из культуральной жидкости (а.с. СССР N 432186, C 12 P 7/48, 1974). Поскольку в известном способе предусмотрено использование батареи последовательно соединенных ферментеров, он характеризуется низкой экономической эффективностью.

Задача изобретения заключается в интенсификации и повышении экономической эффективности способа получения лимонной кислоты.

Поставленная задача решена тем, что в известном непрерывном способе получения лимонной кислоты, включающем постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger на мелассной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением продукта из культуральной жидкости, процесс ферментации осуществляют в две стадии, причем на первой стадии используют мелассу с величиной pH 4,0 - 5,0, ферментацию ведут при температуре 32 - 34^oC, затем через 30 - 48 ч, после снижения интенсивности образования биомассы мицелия начинают непрерывную подачу в ферментационную среду раствора мелассы и питательных солей со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1, на второй стадии используют перетекающую с первой стадии ферментации суспензию микроорганизмов, процесс ведут при температуре 30 - 32^oC и pH среды 2,0 - 3,0, отвод суспензии микроорганизмов со второй стадии ферментации осуществляют со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1, а в процессе выделения продукта используют маточные растворы, образующиеся при кристаллизации, для дополнительного получения солей лимонной кислоты.

В качестве посевного материала для ферментации используют высокопродуктивный штамм гриба A.niger F-718.

Для получения посевного материла мицелий гриба A.niger F-718 подращивают в течение 16 - 24 ч при температуре 32 - 35^oC на мелассной питательной среде с величиной pH 4 - 5, содержащей редуцирующие вещества (PB) - 2%, сахарозу - 0,5%, этиловый спирт - 0,1%, KH₂PO₄ - 0,02%, MgSO₄ - 0,02%, ZnSO₄ • 7H₂O - 10 мг/л, CoSO₄ • 7H₂O - 1,0 мг/л, Na₂MoO₄ - 0,5 мг/л.

Подращивание мицелия на питательной среде, содержащей мелассу, сахарозу, этиловый спирт и микроэлементы (Zn, Co, Mo), способствует улучшению качества посевного материала.

Маточные растворы получающиеся в процессе кристаллизации лимонной кислоты, используют для получения солей лимонной кислоты. Причем из первых или вторых маточных растворов получают чистые соли пищевого или медицинского достоинства, а более загрязненные маточные растворы (вторые или третьи) идут на получение технических солей лимонной кислоты, например натрия лимоннокислого, широко применяемого в производстве моющих средств в качестве заменителя полифосфатов.

Технический результат изобретения, заключающийся в интенсификации и повышения экономической эффективности производства, достигается за счет использования высокопродуктивного штамма гриба A.niger F-718, ведения процесса в непрерывном режиме в две стадии при соблюдении заявленных условий ферментации и использования маточных, образующихся в процессе кристаллизации лимонной кислоты, для получения солей лимонной кислоты.

Ферментация гриба на первой стадии при pH среды 4,0 - 5,0 и температуре 32 - 34^oC способствует оптимизации роста гриба и ускорению самопроизвольного снижения pH среды до величин, оптимальных для биосинтеза лимонной кислоты (2,0 - 3,0).

Наибольшее накопление лимонной кислоты в среде достигается при ведении процесса в непрерывном режиме со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1. Поддержание pH среды на второй стадии ферментации в интервале 2,0 - 3,0 и температуры на уровне 30 - 31^oC способствует повышению кислотообразующей способности гриба A.niger F-718.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Стерильную мелассную среду с величиной pH 5,0, содержащую PB - 2%, сахарозу - 0,5%, этиловый спирт - 0,1%, KH₂PO₄ - 0,02%, MgSO₄ - 0,02%, ZnSO₄ • 7H₂O - 10 мг/л, CoSO₄ • 7H₂O - 0,1 мг/л, Na₂MoO₄ - 0,5 мг/л, засевают мицелием гриба A. niger F-718. Подращивание осуществляют в колбах на качалке при температуре 35^oC в течение 24 ч. Подрaщенный мицелий используют в качестве посевного материала для ферментации.

Ферментацию гриба A.niger F-718 проводят непрерывным способом на мелассной питательной среде в две стадии. Ферментацию на первой стадии осуществляют при начальной величине pH 4,0 и температуре 32^oC. Через 30 ч от начала ферментации после снижения интенсивности образования мицелия процесс переводят на непрерывный режим путем непрерывной подачи в ферментационную среду раствора мелассы (с содержанием PB - 8%) и питательных солей со скоростью разбавления среды (Д) = 0,025 ч^-1. Перетекающая суспензия микроорганизмов с такой же скоростью поступает на вторую стадию (во второй ферментер), где ферментацию ведут при температуре 30^oC. Величину pH на второй стадии снижают до 2,0.

После второй стадии ферментации ферментационный раствор поступает в сборник, затем культуральную жидкость отделяют от биомассы гриба любым способом, например центрифугированием или фильтрованием, лимонную кислоту выделяют также обычным способом, например осаждением в виде цитрата кальция.

Концентрация лимонной кислоты в среде составляет 73 г/л. Выход лимонной кислоты от PB - 91,25%.

Маточные растворы, образовавшиеся в процессе кристаллизации лимонной кислоты, нейтрализуют до pH 7,0 едким натрием, упаривают и кристаллизуют. Кристаллы отделяют, промывают и сушат.

Выход натрия лимоннокислого трехзамещенного (в пересчете на 100%-ный Na₃C₆H₅O₇ • 5,5 H₂O) составляет 95% от содержания соли в растворе.

Пример 2.

Посевной материал для ферментации получают путем засева мицелия гриба A. niger F-718 в стерильную ферментационную среду, содержащую 2% PB, 0,5% сахара, 0,1% этилового спирта и солей по примеру 1. Подращивание осуществляют в колбах на качалке при температуре 32^oC и pH 4,0 в течение 16 ч. Подрaщенный мицелий используют в качестве посевного материала для ферментации.

Ферментацию гриба A.niger F-718 осуществляют непрерывным способом в две стадии. Ферментацию на первой стадии проводят при начальной величине pH 5,0 и температуре 34^oC. Через 48 ч от начала ферментации процесс переводят на непрерывный режим по примеру 1. Подачу питательных компонентов и отвод суспензии микроорганизмов осуществляют со скоростью разбавления среды (Д) - 0,03 ч^-1. Перетекающая суспензия микроорганизмов с такой же скоростью поступает на вторую стадии, где ферментацию ведут при температуре 31^oC. Величину pH на второй стадии снижают до 3,0.

Концентрация лимонной кислоты в среде составляет 75 г/л. Выход лимонной кислоты от PB - 93,7%.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный получают из маточных растворов по примеру 1. Выход соли лимонной кислоты - 93%.

Пример 3.

Посевной материал для ферментации получают по примеру 2. В качестве продуцента лимонной кислоты используют штамм гриба A.niger 228. Ферментацию проводят в непрерывном режиме на мелассной питательной среде в две стадии. Через 36 ч от начала ферментации начинают непрерывную подачу в ферментационную среду раствора мелассы (с содержанием PB - 8%) и питательных солей со скоростью разбавления среды (Д) = 0,03 ч^-1. Перетекающая суспензия микроорганизмов с такой же скоростью поступает на вторую стадию, где ферментацию ведут при pH среды 2,0.

После отделения биомассы гриба культуральную жидкость используют для получения лимонной кислоты.

Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 60 г/л. Выход лимонной кислоты от PB - 75%.

Маточные растворы, образующиеся после отделения кристаллов лимонной кислоты, нейтрализуют гидроокисью калия, упаривают и кристаллизуют, кристаллы промывают и сушат.

Выход калия лимоннокислого трехзамещенного составляет 92% от содержания соли в растворе.

Пример 4.

Посевной материал для ферментации получают по примеру 1. В качестве продуцента лимонной кислоты используют штамм гриба A.niger 945. Ферментацию гриба и перевод процесса на непрерывный режим осуществляют по примеру 1. pH на второй стадии ферментации поддерживают на уровне 2,5. Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости и выделение лимонной кислоты из раствора проводят обычными способами.

Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 66 г/л. Выход лимонной кислоты от PB - 82,5%.

Пример 5.

Получение посевного материала осуществляют аналогично примеру 1. В качестве продуцента лимонной кислоты используют штамм гриба A.niger F-718. Ферментацию проводят в непрерывном режиме на мелассной питательной среде в одну стадию при начальной величине pH среды 5,0 и температуре 34^oC. Через 30 ч от начала ферментации начинают непрерывную подачу в ферментер раствора мелассы (с содержанием PB - 8%) и питательных солей со скоростью разбавления среды (Д) = 0,025 ч^-1. При этом температуру ферментации снижают до 30^oC, pH среды до 2,0 и поддерживают на этом уровне в течение всего процесса.

Суспензия гриба с ферментера поступает на фильтрование, культуральную жидкость после отделения используют для выделения лимонной кислоты.

Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 56 г/л. Выход лимонной кислоты от PB - 70%
Таким образом, исследования по подбору активных штаммов - продуцентов лимонной кислоты (примеры 1-4), а также по оптимизации режимов ее получения показывают, что наибольшей кислотообразующей способностью обладает штамм гриба A.niger F-718.

Максимальный выход лимонной кислоты достигается при ферментации гриба в непрерывном режиме в две стадии.

Примеры 6-10.

Получение посевного материала и ферментацию гриба A.niger F-718 проводят аналогично примеру 1 при оптимальных значениях pH, температуры, скорости разбавления среды и т. д. , но перевод на непрерывный режим осуществляют по истечении указанного в табл. 1 времени от начала ферментации.

Проведенные исследования показали, что рост культуры гриба A.niger F-718 замедляется через 30-36 ч от начала ферментации, что указывает на целесообразность перевода процесса на непрерывный режим по истечении указанного времени. При увеличении времени подращивания культуры без подачи компонентов питания более 40 ч скорость роста культуры снижается из-за недостатка питательных компонентов в среде.

Результаты, представленные в табл. 1 показывают, что наибольший выход лимонной кислоты от концентрации субстрата имеет место при переводе процесса не непрерывный режим через 30 - 48 ч от начала ферментации.

Примеры 11 - 15.

Повторяют процесс, описанный в примере 1, но скорость разбавления среды изменяют в интервале от 0,02 до 0,04 ч^-1 (табл. 2).

Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что при увеличении скорости разбавления среды (Д) выход лимонной кислоты снижается. Наиболее эффективно ведение процесса в непрерывном режиме при Д = 0,025 - 0,03 ч^-1.

Примеры 16 - 20.

Повторяют процесс, описанный в примере 2, но величину pH среды на первой и второй стадиях ферментации устанавливают равной величинам, указанным в табл. 3.

Гриб A.niger развивается в широком интервале pH - от 2,0 до 9. Начальная величина pH оказывает существенное влияние на биосинтез лимонной кислоты. Конидии и мицелий лучше прорастают при pH 6 - 7, однако при этом они сильно разбухают, некоторое количество лопается, в результате чего возрастает риск возникновения посторонней микрофлоры. Кроме того, при указанных значениях pH наблюдается преимущественный биосинтез щавелевой и глюконовой кислот.

Как видно из табл. 3, наиболее целесообразно культивирование гриба при начальной величине pH среды 4,0 - 5,0. При этих значениях pH, в результате быстрого самозакисления среды, гриб преимущественно синтезирует лимонную кислоту.

Поддержание pH среды на второй стадии ферментации в пределах 2,0 - 3,0 также важно, т.к. при этих значениях pH гриб фактически не растет, а его кислотообразующая способность резко возрастает.

Предложенный способ может содержать и другие преимущества, вытекающие из представленного описания и очевидные для специалистов в данной области.

Способ используют в микробиологической, пищевой промышленности. Лимонную кислоту получают путем ферментации гриба Aspergillus niger ВКПМ F-718 на мелассной питательной среде в две стадии. На первой стадии используют мелассу с pH 4,0 - 5,0, ферментацию осуществляют при 32 - 34^oC, затем через 30 - 48 ч начинают непрерывную подачу раствора мелассы и питательных солей со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1. На второй стадии используют перетекающую с первой стадии суспензию микроорганизмов, процесс ведут при 30 - 32^oC и pH 2,0 - 3,0. Отвод суспензии микроорганизмов осуществляют с той же скоростью. Маточные растворы, образующиеся при кристаллизации лимонной кислоты, используют для дополнительного получения солей лимонной кислоты. Для получения посевного материала мицелий гриба А. Niger F-718 подращивают в течение 16 - 20 ч при 32 - 35^oC и pH 4 - 5 на мелассной питательной среде. Изобретение позволяет интенсифицировать процесс лимонной кислоты и утилизировать маточные растворы со стадии кристаллизации. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Непрерывный способ получения лимонной кислоты, включающий постадийную ферментацию гриба Aspergillus niger на мелассной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим выделением продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что процесс ферментации осуществляют в две стадии, причем на первой стадии используют мелассу с величиной pH 4,0 - 5,0, ферментацию ведут при температуре 32 - 34^oC, затем через 30 - 48 ч после снижения интенсивности образования биомассы мицелия начинают непрерывную подачу в ферментационную среду раствора мелассы и питательных солей со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1, на второй стадии используют перетекающую с первой стадии ферментации суспензию микроорганизмов, процесс ведут при температуре 30 - 32^oC и pH среды 2,0 - 3,0, отвод суспензии микроорганизмов со второй стадии ферментации осуществляют со скоростью разбавления среды 0,025 - 0,03 ч^-1, а в процессе выделения продукта маточные растворы, образующиеся при кристаллизации лимонной кислоты, используют для получения солей лимонной кислоты. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-718. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что перед ферментацией посевной материал подращивают в течение 16 - 20 ч при температуре 32 - 35^oC на мелассной питательной среде с величиной pH 4 - 5, содержащей редуцирующие вещества 2%, сахарозу 0,5%, этиловый спирт 0,1%, KH₂PO₄ 0,02%, MgSO₄ 0,02%, ZnSO₄ • 7H₂O 10 мг/л, CoSO₄ • 7H₂O 0,1 мг/л, Na₂MoO₄ 0,5 мг/л.