СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА С Российский патент 1999 года по МПК A61K35/34 

Изобретение относится к технологии выделения биологически активных соединений, а именно цитохрома C, используемого в медицине в качестве антигипоксического средства для нормализации тканевого дыхания при вирусном гепатите, асфикции, пневмонии, астматических состояниях, ишемической болезни сердца, интоксикациях, старческой дегенерации сетчатки глаза, физических перегрузах и т.д.

Известны способы выделения цитохрома C из сердец различных с.-х. животных: лошадей, свиней и других:
1. Патент США 3342796 (Кл. 260-115), сентябрь 1967;
2. Патент ПНР 126445 (Кл. A 61 К 37/02), сентябрь 1984.

Известные способы выделения включают стадии: экстракцию из измельченных сердец, адсорбционную хроматографию на слабом катионите, осаждение балластных белков сульфатом аммония, диализ, повторную хроматографию, повторный диализ.

В частности, согласно способу (2) из 150 кг гомогенизированных свиных сердец препарат экстрагируется 300 л холодной воды pH 4,0 при 4-8^oC в течение 4 часов, затем после нейтрализации и фильтрации экстракта цитохром C адсорбируют на катионите Амберлит ИРС-50 в объеме, расходуя 10 л сорбента на 100 л раствора. Экстрагируют цитохром C 2 M раствором аммиака, pH нейтрализуют до 7,0 соляной кислотой, к раствору добавляют сульфат аммония: 100 г на 1 л раствора, осадок балластных белков отфильтровывают, раствор цитохрома C диализуют 48 часов и повторяют хроматографию и диализ.

Выход цитохрома C 4,9-6,87 г из 100 кг сердца, чистота препарата удовлетворительная.

Указанный способ позволяет в одном цикле переработать большое количество сырья, однако имеет недостатки:
- однократная хроматография на Амберлите ИРС-50 не позволяет сразу получить достаточной степени чистоты и большой концентрации цитохрома C в растворе,
- длительный по времени диализ приводит к потерям препарата, т.к. цитохром C относительно небольшая по размерам молекула, ММ которой всего лишь 12700 Д,
- применение сульфата аммония для осаждения балластных белков и аммиака водного для десорбции цитохрома C требует последующего тщательного обессоливания от нежелательных ионов NH₄ и SO₄, если цитохром C применяется как лекарственный препарат. Кроме того, указанный способ не предусматривает выделения других биологически активных соединений из сердца.

Предлагается способ выделения цитохрома C из сердца сельскохозяйственных животных, включающий экстракцию, хроматографию, осаждение балластных белков нейтральными солями, отличающийся тем, что с целью увеличения выхода целевого продукта и комплексного использования сырья
1. экстракцию препарата из гомогенизированных сердец осуществляют 0,2-0,5%-ным раствором серной кислоты при pH 4,0-4,5 с последующей нейтрализацией экстракта раствором гидроокиси Ca или Ba, образующиеся в экстракте осадки сульфата Ca или Ba облегчают фильтрацию суспензии из животного сырья, кроме того, из-за низкой растворимости солей ионная сила экстракта сравнительно низка, что позволяет с наименьшими потерями осуществлять сорбцию цихохрома C,
2. хроматографию отфильтрованного экстракта проводят на колонке с макропористым катионитом при pH 8-9, что позволяет разделить цитохром C и миоглобин, который при указанных условиях не сорбируется на колонке, миоглобин собирается отдельно и используется в качестве ценной железосодержащей добавки, концентрирование раствора цитохрома C после хроматографии методом ультрафильтрации позволяет уменьшить потери препарата в последующей стадии осаждения балластных белков,
3. использование хлористого натрия для осаждения балластных белков позволяет исключить в конечном препарате ионы NH₄ и SO₄. Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить технологическое время выделения цитохрома C, увеличить его выход и комплексно использовать ценное сырье - сердце с.-х. животных.

Пример 1.

10 кг гомогенизированных сердец крупного рогатого скота суспендируют в 20 л 0,25% раствора серной кислоты при pH 4,5. Экстрагируют 2 ч при постоянном перемешивании. Фарш отделяют центрифугированием при 3500 об/мин. К полученному экстракту при перемешивании добавляют 60 г гидроокиси бария до достижения pH 8,5. Суспензию оставляют на 3 часа. Выпавший осадок отделяют фильтрацией. Фильтрат пропускают через колонку с макропористым катионитом и промывают 25% раствором сульфата аммония. Прошедший через колонку раствор (проскок) собирают для выделения миоглобина. Элюцию цитохрома C осуществляют 5% раствором сульфата аммония pH 8,5. Объем элюата 1 л. Раствор цитохрома C подвергают концентрированию и диафильтрации с использованием мембран в виде полых волокон марки ВПУ-50-ПА. Объем концентрата 200 мл. Осаждение балластных белков из концентрата осуществляют добавлением 20 г NaCl. Осадок отфильтровывают. Супернатант обессоливают и лиофилизируют. Выход цитохрома C 0,85 г. Чистота препарата соответствует ФС 42-2533-78.

Пример 2.

10 кг гомогенизированных сердец крупного рогатого скота суспендируют в 20 л 0,4% раствора соляной кислоты при pH 4,0. Экстрагируют 1 час при перемешивании. Фарш отделяют центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют 50 г гидроокиси кальция до pH 8,5. Суспензию оставляют на 3 ч. Выпавший осадок отделяют фильтрацией. Фильтрат пропускают через колонку с макропористым катионитом. Проскок собирают для выделения миоглобина. Эволюцию цитохрома C осуществляют 10% раствором сульфата аммония pH 8,5. Элюат концентрируют и обессоливают методом ультрафильтрации на мембранах в виде полых волокон. Осаждение балластных белков из концентрата осуществляют добавлением 120 г/л NaCl. Супернатант обессоливают и лиофилизируют. Выход цитохрома C 0,8 г. Чистота препарата соответствует ФС 42-2533-78.

Изобретение относится к технологии выделения биологически активных соединений, а именно цитохрома С, используемого в медицине в качестве антигипоксического средства для нормализации тканевого дыхания при вирусном гепатите, асфикции, пневмонии, астматических состояниях, ишемической болезни сердца, интоксикациях, старческой дегенерации сетчатки глаза, физических перегрузках. Способ включает экстракцию препарата из гомогенизированных сердец 0,2-0,5% раствором серной кислоты при pH 4,0 - 14,5 с последующей нейтрализацией экстракта раствором гидроокиси Са или Ва, хроматографию отфильтрованного экстракта на колонке с макропористым катионитом при pH 8 - 9, что позволяет разделить цитохром С и миоглобин, который при указанных условиях не сорбируется на колонке, миоглобин собирают отдельно и используют в качестве ценной железосодержащей добавки, использование хлористого натрия для осаждения балластных белков в количестве 90 - 120 г соли на 1 л раствора. Технический результат: способ позволяет сократить время выделения цитохрома С, увеличить его выход и комплексно использовать ценное сырье - сердце с.-х. животных.

Способ выделения цитохрома С из сердца сельскохозяйственных животных, включающий экстракцию, хроматографию, осаждение балластных белков нейтральными солями, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и комплексного использования сырья, экстракцию препарата осуществляют 0,2 - 0,5% раствором серной кислоты при рН 4,0 - 4,5 с последующей нейтрализацией экстракта гидроокисью Са или Ва, хроматографию отфильтрованного экстракта проводят на макропористом катионите при рН 8,0 - 9,0 с последующим концентрированием элюата методом ультрафильтрации, осаждение балластных белков из концентрированного элюата, содержащего цитохром С, осуществляют добавлением хлористого натрия в количестве 90 - 120 г соли на 1 л раствора.