СЧЕТНАЯ КАМЕРА С СЕТКАМИ ГОРЯЕВА Российский патент 1999 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и биологии, точнее к лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки количественного состава клеточных популяций (кровь, клеточные культуры).

Известна счеткая камера с сетками Бюркера [1]. Сетка Бюркера состоит из 9 одинаковых квадратных полей, которые разделены тройными линиями. Внутри каждого поля с помощью взаимно пересекающихся двойных линий выделены 12 больших квадратов и малые квадраты (по 4 у углов каждого большого квадрата). Площадь одного большого квадрата 1/25 мм², площадь одного малого квадрата 1/400 мм². Всего сетка содержит 144 больших квадрата. На долю этих квадратов в пределах каждого из 9 полей приходятся 0,64 мм², на долю малых квадратов, промежутков между большими квадратами и обрамления полей - 0,36 мм². Площадь сетки Бюркера - 9,0 мм², объем камеры - 0,9 мм³. Существенные признаки счетной камеры с сетками Бюркера, совпадающие с таковыми заявляемого изобретения, следующие: предметное стекло, в котором имеются углубления с сетками, выгравированными на их дне; площадь большого и малого квадратов, площадь сетки, объем камеры.

Вероятность попадания клеток в квадраты сетки счетной камеры подчиняется распределению Пуассона [2, 3]. Метрологической основой установления числа частиц, в том числе числа клеток в суспензии, является свойство распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего [4 - 9]. У счетной камеры с сетками Бюркера отсутствуют элементы, способствующие нахождению средних, которые удовлетворяют свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, при подсчете эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и культивируемых клеток.

Известна счетная камера с сетками Нейбауэра [1]. Сетка Нейбауэра состоит из 9 по-разному разграфленных полей. Центральное поле содержит 25 больших квадратов, в каждом из которых имеются 16 малых квадратов. Четыре боковых поля пересечены в одном направлении. Каждое из угловых полей разделено на 16 пустых квадратов. Площадь одного большого квадрата 1/25 мм², площадь одного малого квадрата 1/400 мм², площадь сетки Нейбауэра 9,0 мм², объем камеры 0,9 мм³. Существенные признаки счетной камеры с сетками Нейбауэра, совпадающие с таковыми заявляемого изобретения, следующие: предметное стекло, в котором имеются углубления с сетками, выгравированными на их дне; площадь большого и малого квадратов, площадь сетки, объем камеры. У счетной камеры с сетками Нейбауэра отсутствуют элементы, способствующие нахождению средних, которые удовлетворяют свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, при подсчете эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и культивируемых клеток.

Известна счетная камера с сетками Горяева [1]. Сетка Горчяева состоит из 225 больших квадратов. Среди них 100 квадратов пустых, 100 - пересеченных в одном направлении, 25 - пересеченных в двух взаимно перпендикулярных направлениях. В каждом из указанных 25 больших квадратов содержатся 16 малых квадратов. Площадь одного большого квадрата 1/25 мм², площадь одного малого квадрата 1/400 мм², площадь сетки Горяева 9,0 мм², объем камеры 0,9 мм³. Существенные признаки счетной камеры с сетками Горяева, совпадающие с таковыми заявляемого изобретения, следующие: предметное стекло, в котором имеются углубления с сетками, выгравированными на их дне; площадь большого и малого квадратов, площадь сетки, объем камеры. У счетной камеры с сетками Горяева отсутствуют элемены, способствующие нахождению средних, которые удовлетворяют свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, при подсчете эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и культивируемых клеток. Последнее устройство взято за прототип.

Предложенное устройство позволяет повысить точность оценки плотности клеточной суспензии за счет введения элементов, способствующих нахождению средних, удовлетворяющих свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, и соответствующего изменения методики подсчета клеток. Повышение точности оценки плотности клеточной суспензии в результате нахождения указанных средних основана на возможности легко определить доверительные пределы среднего при заданном уровне значимости и сравнить два средних. Этот технический результат достигается тем, что рядом с сеткой Горяева выгравировываются квадраты (пуассоновские единицы), площадь которых в 10 раз меньше той, на которой подсчитывают эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и культивируемые клетки.

На фиг. 1 изображена счетная камера с сеткой Горяева и элементами, способствующими нахождению средних, удовлетворяющих свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего (пуассоновскими единицами).

Счетная камера состоит из толстого предметного стекла (1), в центре которого имеется средняя пластинка (2), разделенная на две половины поперечной канавкой (3). Каждая половина содержит углубление с сеткой Горяева (4). С каждой стороны средней пластинки располагаются краевые пластинки (5), отделенные от средней пластинки канавками (6) и предназначенные для притирания покровного стекла. Высота краевых пластинок на 0,1 мм меньше, чем высота углублений с сетками средней пластинки. Рядом с сетками выгравированы квадраты (пуассоновские единицы), маркированные буквами Э (эритроциты), Т (тромбоциты), Л (лейкоциты) и КК (культивируемые клетки) (7). Площади пуассоновских единиц для определения средних в случаях подсчета эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов и культивируемых клеток равны соответственно 0,02, 0,1, 0,4 и 1,8 мм². Стороны квадратов для эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и культивируемых клеток, с точностью до 0,01 мм, равны соответственно 0,14, 0,32, 0,63 и 1,34 мм. Обоснование установления размеров пуассоновских единиц дано ниже.

Счетную камеру заполняют общепринятыми способами.

Наиболее часто подсчитывают эритроциты, лейкоциты и тромбоциты периферической крови, а также культивируемые клетки человека и животных (клетки однослойных и суспензионных культур).

Для подсчета эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов периферической крови человека существуют стандартные методики применительно к счетной камере с сеткой Горяева [10]. Согласно этим методикам подсчет эритроцитов осуществляют в 5, тромбоцитов в 25, лейкоцитов в 100 больших квадратах сетки счетной камеры. Таким образом, учитывая то, что площадь большого квадрата равна 0,04 мм², эритроциты подсчитывают на площади 0,2мм², тромбоциты - на площади 1,0 мм², лейкоциты - на площади 4,0 мм². В опытах с культурами клеток удобно подсчитывать клетки на поверхности обеих сеток (в 450 больших квадратах), то есть на площади 18,0 мм². Опытами с культурами клеток установлено, что если принять за единицу подсчета 1/5 часть сетки Горяева (1,8 мм²; 45 больших квадратов) и произвести подсчет клеток в 10 таких единицах, то полученное среднее из этих 10 подсчетов позволяет обеспечить удовлетворительное соответствие равенству стандартного отклонения квадратному корню из среднего. Для такого соответствия достаточно в целом подсчитать в указанных 10 единицах сетки счетной камеры примерно 200 клеток. Дальнейшее увеличение числа сосчитанных клеток не повышает точности подсчета. Нахождение среднего указанным способом и общее число сосчитанных клеток дают возможность аппроксимировать распределение Пуассона нормальным распределением [9]. Таким образом, использование 1/5 части сетки Горяева в качестве единицы подсчета позволяет легко определять среднее, обеспечивающее соответствие данных подсчета свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего и аппроксимировать распределение Пуассона нормальным распределением.

Методика определения среднего с использованием пуассоновских единиц заключается в следующем. Суспензии эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов разводят в соответствии со стандартными методиками (суспензии эритроцитов и тромбоцитов в 200 раз, суспензию лейкоцитов в 20 раз).

В случаях суспензий культивируемых клеток сначала проводят ориентировочный подсчет клеток на площади, равной двум большим квадратам, а затем разводят суспензию с таким расчетом, чтобы общее число клеток над сеткой счетной камеры было равно 100.

Для получения среднего, соответствующего свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, полученные числа делят на 10. При работе с культивируемыми клетками, где разведения исходной суспензии относительно невелики (обычно не более чем в 4 раза), можно умножить предварительно число сосчитанных клеток на величину разведения. При работе с клетками крови, где величины разведения велики (20 и 200 раз), целесообразно оперировать непосредственно с числами сосчитанных клеток.

Таким образом, подсчет клеток осуществляется не в самих пуассоновских единицах сетки счетной камеры, а эти единицы являются ориентирами для нахождения среднего.

Использование пуассоновских единиц сетки счетной камеры позволяет найти среднее, соответствующее свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, и доверительные пределы для среднего; осуществить сравнение двух средних; определить время удвоения популяции клеток при увеличении размеров этой популяции; определить конечные точки при воздействии на клетки статических и токсических агентов.

Примеры использования пуассоновских единиц.

Определение среднего и его доверительных пределов.

При подсчете лейкоцитов в 5 больших квадратах сетки Горяева получено число 150, что соответствует 7500 лейкоцитов в 1 мкл или 7,5 • 10⁹/л. Среднее, по данным соотнесения с пуассоновской единицей для лейкоцитов, равно 15 лейкоцитам. Квадратичную ошибку среднего, , исходя из аппроксимации распределения Пуассона нормальным распределением, вычисляют по формуле , где - выборочное среднее для распределения Пуассона (в данном случае - 15 лейкоцитов), а n - число подсчетов (в данном случае 10).

Следовательно, при 5,2 и 1% уровнях значимости истинное среднее (m) будет находиться соответственно в следующих доверительных пределах:

Таким образом, в данном случае при 5,2 и 1% уровнях значимости m будет находиться в следующих доверительных пределах:
15 - 2,3 • 1,22 < 15 < 15 + 2,3 • 1,22 или, округляя до 0,1, 12,2 < 15 < 17,8 (Р = 0,05);
15 - 2,8 • 1,22 < 15 < 15 + 2,8 • 1,22 или, округляя до 0,1, 11,6 < 15 < 18,4 (Р = 0,02);
15 - 3,3 • 1,22 < 15 < 15 + 3,3 • 1,22 или, округляя до 0,1, 11,0 < 15 < 19,0 (Р = 0,01).

Сравнение плотностей двух суспензий
При определении плотностей неразведенных суспензий клеток Hela (культивируемая постоянная линия клеток карциномы матки человека) с интервалом в 1 сут в первый раз в 2 сетках Горяева оказалось 280 клеток, а во второй раз - 198 клеток (в перерасчете на 1 мл соответственно 1,6 • 10⁵ и 1.5 • 10⁵ клеток). Средние, , по данным соотнесения с пуассоновской единицей для культивируемых клеток равны соответственно 28,0 и 19,8 клетки. Сравнение двух средних для совокупностей, подчиняющихся распределению Пуассона, с учетом аппроксимации этого распределения нормальным распределением осуществляют по формуле

где d_H - найденное значение квантиля уровня 1 - α(1 - α, или Р - доверительная вероятность) для нормального распределения, сравниваемое с табличным значением этой величины (d_T) при заданной доверительной вероятности (уровне значимости).

В данном случае

Различие между следует признать статически значимым.

Определение времени удвоения популяции культивируемых клеток
Клетки постоянной линии Hela выращивали при 36^oС во флаконах Карреля, используя смесь среды 199 и 20% сыворотки крупного рогатого скота. Каждые 5 сут удаляли кондиционированную среду и вносили свежую питательную смесь. Клетки отслаивали смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена (1: 1). В этих условиях суспензии, используемые для подсчета, были однородными, и клетки почти не образовывали конгломератов. Клетки подсчитывали обычно каждые 2 сут. Исходное среднее и его доверительные пределы при 1% уровне значимости, по данным соотнесения с пуассоновской единицей для культивируемых клеток, оказались равными 15,2 ± 4,1 клетки. На 2-е, 4-е, 6-е, 9-е, 11-е и 13-е сут средние и их доверительные пределы равнялись соответственно 26,7 ± 5,4; 29,4 ± 5,7; 53,1 ± 7,6; 106,0 ± 10,1; 161,6 ± 13,3 и 140,8 ± 12,4 клетки. Время удвоения популяции определяли аналитически и графически. При аналитическом способе использовали формулу

где t - время удвоения популяции, сут;
T - длительность логарифмической фазы роста, сут;
средние соответственно для исходной и конечной суспензий, полученные путем соотнесения с пуассоновской единицей для культивируемых клеток.

При графическом способе логарифмы средних и доверительных пределов наносили на ось ординат, сутки - на ось абсцисс (фиг. 2). Время удвоения популяции определяли по формуле
t = lg2/tgα,
где t - время удвоения популяции, сут;
α - угол между экспериментальной прямой и осью абсцисс.

По данным аналитического метода время удвоения популяции оказалось равным 3,31 сут (~79,4 ч). Отмечено почти полное отсутствие разброса точек на графике, что позволило легко провести через них прямую. Величина tg α = 0,09. Согласно формуле для графического метода t = 3,34 сут (~80,2 ч).

Таким образом, использование пуассоновской единицы позволило с высокой точностью определить время удвоения популяции клеточной культуры.

Определение 50% конечной точки при действии токсического агента на культуру клеток
На однослойные культуры клеток HeLa воздействовали метилртутьйодидом в концентрациях 14,6; 7,3; 3,65; 1,8; 0,9 и 0,45 мкмоль. Спустя 24 ч после внесения препарата клетки отслаивали смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена (1:1) и осуществляли подсчет. Исходное среднее число клеток, по соотнесению с пуассоновской единицей для культивируемых клеток, оказалось равным 41,4 клетки; средние для культур, в которые вносили метилртутьйодид, равнялись соответственно 0,0; 3,2; 17,0; 19,6; 31,6 и 40,6 клетки (1-я серия опытов); 0,0; 11,0; 16,5; 20,7; 26,8 и 41,8 клетки (2-я серия опытов); 0,0; 6,8; 9,7; 13,2; 15,3 и 23,2 клетки (3-я серия опытов).

Логарифм средней летательной дозы для клеток в культуре тканей (LTCD50) определяли по формуле lg LTCD50 = 1/2 (lgD_n + lgD_n+1) - 1/2 [h₁(lgD₂ - lgD₀ + h₂(lgD₃ - lgD₁) + , ... , + h_n (lgD_n+1 - lgD_n-1)] , где
D₀ - доза, при которой гибель клеток не наблюдается; D_{1,2, 3,...,n} - нарастающие дозы, при которых гибель клеток увеличивается; D_n+1 - доза, при которой погибают все клетки; h_1,2,...,n - соответствующие нарастающим дозам доли погибщих клеток (отношение чисел погибших клеток к исходному числу клеток) [11].

Числа клеток определяются как выборочные средние . Из величин логарифмов LTCD50 определяли LTCD50. В указанных сериях опытов LTCD50 оказались равными 2,48; 2,52 и 2,89 мкмоль.

Таким образом, определение средней летальной дозы при воздействии токсического агента на культуру клеток с использованием при подсчете клеток пуассоновской единицы позволило получить близко совпадающие величины этой дозы.

Источники информации:
1. Альперин П. Камеры счетные // Большая медицинская энциклопедия. Т. 12. 2-е изд. - М.: 1959 с.57 - 65.

2. Student. On the error of counting with a haemocytometer // Biometrica. - 1907. - V. 5. - Part 3. - P. 351 - 360.

3. Student. An explanation of deviations from Poisson's law in practice // Biometrica. - 1919. - V. 12. - Parts 3 - 4. - P. 211 - 215.

4. Abbe E. Uber Blutkorperchenzahlung // Sitzungsberichte der Gesellsch. f. Med. Und Naturwissensch. in Jena. - Jg. 1878. - N 29. - S. 98 - 105.

Reichel J. Blutkorperchenzahlung. Experimentelle Studien der Berechnung der Fehler der Menhodik und die Bewertung der Fehler bei Einzel- und Serienzahlungen // Fol. Haematol. - 1930. - B. 41. - N. 41. - S. 307 - 332.

6. Berkson J., Magath Th.B., Hurn M. Laboratory standards in relation to chance, fluctuations of the erytrocyte count as estimated with the hemocytometer // J.Am. Statist. Assoc. - 1935. - V. 30. - N. 190. - P. 414 - 426.

7. Berkson J., Magath Th.B., Hurn M. Error of estimate of blood cell count as made with the hemocytometer. - Am. J. Physiol. - 1940. - V. 128. - N. 2. - P. 309 - 323.

8. Налимов В.В. Применение математической статистике при анализе вещества. - М.: Физматгиз, 1960, 431 с.

9. Бенюмович М.С. Статистическое обоснование оптимальных условий подсчета клеток в однослойных культурах. Лаб. Дело. - 1965 N 10, с. 609 - 614.

10. Золотницкая Р.П. Методы гематологических исследований. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина. 1987 с. 106 - 148.

11. [Waerden van der B.L.] Варден ван дер Б.Л. Математическая статистика // Пер. с нем. - М.: Иностранная литература, 1960, 434 с.

Изобретение предназначено для введения в конструкцию счетной камеры с сетками Горяева элементов, способствующих нахождению средних, которые удовлетворяют свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, при подсчете эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и культивируемых клеток. Рядом с сетками выгравировываются квадраты (пуассоновские единицы), площадь которых составляет 1/10 площадей, на которых подсчитывают эритроциты, тромбоциты и лейкоциты по стандартным методикам (соответственно 0,02, 0,1 и 0,4 мм², а площадь квадрата (пуассоновской единицы) для культивируемых клеток равна 1,8 мм², что составляет 1/10 площади, на которой удобно подсчитывать культивируемые клетки (18,0 мм²). Числа клеток, установленные по принятым методикам, делят на 10, получая таким образом искомые средние. Пуассоновские единицы служат индикаторами для осуществления этого деления. Нахождение средних, удовлетворяющих свойству распределения Пуассона о равенстве стандартного отклонения квадратному корню из среднего, с последующей аппроксимацией распределения Пуассона нормальным распределением позволяет легко вычислять доверительные пределы среднего, сравнивать средние, определять время удвоения клеточной популяции, устанавливать конечные точки при воздействии на клетки статических и токсических агентов. 1 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Счетная камера с сетками Горяева, отличающаяся тем, что рядом с сетками выгравированы квадраты разной площади (пуассоновские единицы), маркированные в соответствии с наименованиями наиболее часто подсчитываемых клеток (эритроциты-Э, тромбоциты-Т, лейкоциты-Л, культивируемые клетки -КК). 2. Камера по п.1, отличающаяся тем, что площадь пуассоновской единицы при подсчете эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов составляет 1/10 площади участка сетки счетной камеры, используемой при подсчете указанных клеток в соответствии со стандартными методиками, а площадь пуассоновской единицы для культивируемых клеток равна 1/5 площади сетки Горяева.