ПРОИЗВОДНЫЕ АНЕЛЛИРОВАННОГО ДИГИДРОПИРИДИНА ИЛИ ИХ СОЛИ С ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПЕРЕНОСИМЫМИ КИСЛОТАМИ И СРЕДСТВО, БЛОКИРУЮЩЕЕ НЕСЕЛЕКТИВНЫЕ КАТИОННЫЕ КАНАЛЫ Российский патент 1999 года по МПК C07D495/04 A61K31/47 C07D495/04 C07D211/00 C07D233/00 

Изобретение относится к новым производным дигидропиридина, обладающим ценными фармакологическими свойствами, в частности к производным анеллированного дигидропиридина и к средству, блокирующему неселективные канальцы катионов.

Известны производные анеллированного дигидропиридина, которые можно применять в качестве средства, обладающего кардиозащитным действием (см. заявку EP 0251194 A1, МКИ: C 07 D 217/18, A 61 K 31/47, 1988 г.).

Задачей изобретения является разработка производных анеллированного дигидропиридина, которые можно применять в качестве средства, блокирующего неселективные канальцы катионов.

Поставленная задача решается производными анеллированного дигидропиридина общей формулы (I)

где A - означает бензо- или тиеногруппу, заместители R², независимо друг от друга, означают гидроксил, алкоксил с 1 -4 атомами углерода, бензилокси-группу, галоген, алкил с 1 - 4 атомами углерода,
m - O, если A представляет собой тиеногруппу, и 2, если A означает бензогруппу,
R¹ - циклоалкил с 4 - 6 атомами углерода, циклоалкилалкил с 4 - 6 атомами углерода в циклоалкильной части и 1 - 5 атомами углерода в алкильной части, или группа формулы

в которой R⁵ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, азидогруппу, галоген, алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, а n равно 1, 2 или 3, причем n может быть равно 0 в том случае, если A означает тиеногруппу,
R³ и R⁴ независимо друг от друга означают водород, неразветвленный или разветвленный алкенил с 3 - 6 атомами углерода, неразветвленный или разветвленный алкинил с 3 - 6 атомами углерода, неразветвленный или разветвленный алкил с 1 - 12 атомами углерода, причем алкил может быть замещен тиенилом или фенилом, причем фенил может быть моно-, ди- или тризамещен алкилом с 1-4 атомами углерода, азидогруппой, алкоксилом с 1 - 4 атомами углерода, бензилоксигруппой, галогеном, трифторметилом, адамантилом, группой -SO₂NH₂, или мостиком -O-CH₂-O-, пиридилом, пирролидинилом, N-метилпирролидинилом, морфолиногруппой, адамантилом, нитрилогруппой, или R³ означает водород, a R⁴ - циклогексил, фенил, фторфенил, пиридил или N-бензилпиперидил, или R³ и R⁴ вместе с атомом азота, с которым они связаны, означают пирролидинил, пиперидинил, группу формулы

или пиперазинил, незамещенный или замещенный у атома метилом, незамещенным фенилом, моно- или диалкоксифенилом с 1 - 4 атомами углерода в каждой алкоксильной части, пиримидинилом, фенилалкилом с 1 - 4 атомами углерода в алкильной части или группой формулы

или их солями с физиологически переносимыми кислотами.

Благодаря способности к блокировке неселективных канальцев катионов новые производные дигидропиридина вышеприведенной формулы (I) и их соли пригодны для терапии хронических воспалительных процессов, язвенного колита и болезни Крона, а также для защиты сердца и мозга и торможения роста клеток.

Ввиду указанной биологической активности соединения формулы (I) представляют собой активное вещество, блокирующее неселективные канальцы катионов средство, являющееся дополнительным объектом настоящего изобретения.

Соединения общей формулы (I) образуют таутомеры формулы (Ia)

Таутомеры можно разделять известными методами, например, путем колоночной хроматографии или избирательного восстановления (бораном натрия или путем каталитического восстановления).

Соединения формулы (Ia) могут иметься в виде цис- или трансизомеров:

В том случае, если структура соединения не указывается, то под соединением формулы (I) следует подразумевать также соединение формулы (Ia).

Соединения общей формулы (I) можно получать известными методами, например, путем циклизации диамида малоновой кислоты общей формулы (III)

в которой R¹, R², R³, R⁴ и m имеют вышеуказанные значения;
Ar означает фенил, индолил или тиенил,
в присутствии стандартного агента конденсации и, при необходимости, в среде инертного растворителя.

Реакцию можно осуществлять в широком диапазоне температуры, предпочтительно при температуре в пределах от 50^oC до точки кипения реакционной смеси.

Продолжительность реакции зависит от исходного соединения III и составляет 2 -15 часов.

Соединения общей формулы I представляют собой основания, и их можно известным методом переводить в любые физиологически приемлемые аддукты (соли), используя неорганические или органические кислоты.

Предлагаемые соединения можно дать орально, парентерально или путем локальной аппликации. Необходимая дозировка зависит от конкретной ситуации и вида препарата, ее можно определять путем опытов. Пригодными видами препаратов являются, например, таблетки, капсулы, свечи, растворы, соки, эмульсии, аэрозоли или диспергируемые порошки, которые помимо активного вещества содержат еще обычные целевые добавки. Ниже приводятся примеры возможных фармацевтических препаратов.

Примеры фармацевтических препаратов
а) Драже.

1 ядро драже содержит:
Активное вещество общей формулы I - 30,0 мг
Молочный сахар - 100,0 мг
Кукурузный крахмал - 75,0 мг
Желатина - 3,0 мг
Стеарат магния - 2,0 мг
Всего: - 210,0 мг
Получение
Смесь из активного вещества, молочного сахара и кукурузного крахмала с добавкой 10%-ного водного раствора желатины гранулируют посредством сита с размером отверстий 1 мм, сушат при 40^oC и еще раз протирают через сито. Получаемый таким образом гранулят смешивают со стеаратом магния и прессуют. Получаемые при этом ядра покрывают оболочкой, наносимой с помощью водной суспензии из сахара, двуокиси титана, талька и гуммиарабика. Готовые драже полируют пчелиным воском.

б) Таблетки
Активное вещество общей формулы I - 30,0 мг
Молочный сахар - 100,0 мг
Кукурузный крахмал - 70,0 мг
Растворимый крахмал - 7,0 мг
Стеарат магния - 3,0 мг
Всего - 210 мг
Получение
Активное вещество и стеарат магния гранулируют с водным раствором растворимого крахмала, гранулят сушат и тщательно смешивают с молочным сахаром и кукурузным крахмалом. Затем смесь прессуют в таблетки весом 210 мг.

в) Капсулы
Активное вещество общей формулы - 20,0 мг
Молочный сахар - 230,0 мг
Кукурузный крахмал - 40,0 мг
Тальк - 10,0 мг
Всего - 300,0 мг
Получение
Активное вещество, молочный сахар и кукурузный крахмал смешивают сперва в смесителе, а затем в измельчающей машине. Смесь еще раз подают в смеситель и тщательно смешивают с тальком, после чего посредством автомата осуществляют розлив смеси в капсулы из твердой желатины.

г) Таблетки
Активное вещество общей формулы (I) - 40,0 мг
Молочный сахар - 100,0 мг
Кукурузный крахмал - 50,0 мг
Коллоидная кремневая кислота - 2,0 мг
Стеарат магния - 3,0 мг
Всего - 200,0 мг
Получение
Активное вещество смешивают с частью вспомогательных веществ и гранулируют с раствором растворимого крахмала в воде. После сушки гранулята примешивают остаток вспомогательных веществ, после чего смесь прессуют в таблетки.

д) Драже
Активное вещество общей формулы (I) - 20,0 мг
Молочный сахар - 100,0 мг
Кукурузный крахмал - 65,0 мг
Коллоидная кремневая кислота - 2,0 мг
Растворимый крахмал - 5,0 мг
Стеарат магния - 3,0 мг
Всего - 195,0 мг
Получение
Активное вещество и вспомогательные вещества прессуют аналогично примеру 1 в ядра, которые при использовании сахара, талька и гуммиарабика дражируют обычным методом.

е) Суппозитории
Активное вещество общей формулы (I) - 50,0 мг
Молочный сахар - 250,0 мг
Масса для изготовления суппозиториев - До 1,7 г
Получение
Активное вещество и молочный сахар смешивают друг с другом, и смесь равномерно суспендируют в расплавленной массе для изготовления суппозиториев. Суспензии разливают в охлаждаемые формы. Таким образом получают суппозитории весом 1,7 г.

ж) Ампулы
Активное вещество общей формулы (I) - 20,0 мг
Хлористый натрий - 5,0 мг
Би-дистиллированная вода - До 2,0 мл
Получение
Активное вещество и хлористый натрий растворяют в би-дистиллированной воде и получаемый раствор стерильно разливают в ампулы.

з) Ампулы
Активное вещество общей формулы (I) - 10,0 мг
Хлористый натрий - 7,0 мг
Би-дистиллированная вода до - 1,0 мл
и) Капли
Активное вещество общей формулы (I) - 0,70 г
Сложный метиловый эфир п.-гидроксибензойной кислоты - 0,07 г
Сложный пропиловый эфир п.-гидроксибензойной кислоты - 0,03 г
Деминерализованная вода - До 100,00 мл
Получение
Активное вещество и консерванты растворяют в деминерализованной воде, раствор фильтруют и разливают в бутылки, каждая емкостью 100 мл.

Предлагаемые соединения можно применять энтерально или парентерально. Преимущественно при оральном употреблении дают от 0,1 до 500 мг активного вещества на одну дозу, а при интравенозном употреблении - от 0,05 до 150 мг на одну дозу. В случае таблеток, драже, ампул и соков отдельная доза составляет 1 - 200 мг, предпочтительно 20 - 50 мг на 75 кг веса тела. В зависимости от серьезности заболевания дают в общем 1 - 3 отдельные дозы в день.

Нижеследующим примеры служат для пояснения получения производных дигидропиридина общей формулы (I).

Пример 1
Гидрохлорид 3,4-дигидро-1-бензил-6,7-диметокси- α -[ди-2-( 2,3,4-триметоксифенил)этил]аминокарбонил-изохинолина

а) N, N-ди-[2-(2,3,4-триметоксифенил)-этил] амид 2-(3,4- димeтoкcифeнил)этил-аминокарбонил-фенил-уксусной кислоты
К раствору 18,0 г (52,4 ммоль) сложного моноэтилового эфира 2- (3,4-диметоксифенил)этиламида фенилмалоновой кислоты в 150 мл безводного диметилформамида при комнатной температуре при перемешивании порциями добавляют 9,0 г (55,5 ммоль) N,N'- карбонилдиимидазола. По истечении 30 минут добавляют 18,0 г (44,3 ммоль) ди-[2-(2,3,4-триметоксифенил)этил]амина и размешивают в течение 30 минут. Затем растворитель отгоняют в вакууме, остаток поглощают в 1,5 л метиленхлорида и последовательно встряхивают два раза с 250 мл воды и два раза с 200 мл 1 н. соляной кислоты. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия, сгущают и остаток очищают путем хроматографии на содержащей силикагель колонке с использованием в качестве элюента смеси метиленхлорида и метанола в соотношении 100 : 2, после чего кристаллизуют из смеси сложного эфира уксусной кислоты и простого эфира.

Выход: 35,5 г.

б) Гидрохлорид 3,4-дигидро-1-бензил-6,7-диметокси -α- [ди-2- (2,3,4-триметоксифенил)этил]аминокарбонил-изохинолина
35,0 г (47,5 ммоль) получаемого на стадии а) амида и 15 мл (164 ммоль) хлорокиси фосфора в 150 мл безводного ацетонитрила кипятят в течение 30 минут. По окончании реакции (контроль путем тонкослойной хроматографии) растворитель и непрореагировавшую хлорокись фосфора отгоняют в вакууме. К остатку добавляют ледяную воду, подщелачивают добавлением содового раствора и порциями экстрагируют примерно 1 л метиленхлорида. Органическую фазу промывают водой, сушат над сульфатом натрия и сгущают. Остаток дважды очищают путем хроматографии на наполненной силикагелем колонке, используя в качестве первого элюента смесь метиленхлорида и метанола в соотношении 100: 2 до 100: 4, а второго элюента - смесь метиленхлорида и сложного эфира уксусной кислоты в соотношении 1 : 1.

Полученный очищенный продукт (6,5 г) путем растворения примерно в 50 мл этанола и добавления спиртовой соляной кислоты преобразуют в гидрохлорид. В результате сушки и сгущения в высоком вакууме при температуре 50^oC получают 11,5 г целевого продукта.

Точка плавления: 56 - 64^oC, аморфно.

Пример 2
N-(2-(3,4-диметоксифенил)этил)-N', N'-ди-(2-(2- фторфенил)этил)-диамид 2-фенилмалоновой кислоты
К раствору 17,2 г (0,05 моль) N-(2-(3,4-диметоксифенил)этил)- моноамида фенилмалоновой кислоты в 200 мл безводного метиленхлорида при комнатной температуре и при перемешивании порциями добавляют 8,1 г (0,05 моль) N,N'-карбонилдиимидазола. По истечении примерно 30 минут в реакционную смесь при перемешивании подают суспензию 14,9 г (0,05 моль) гидрохлорида ди-(2-(2-фторфенил)этил)амина и 5,1 г (= 6,4 мл; 0,05 моль) триэтиламина в 100 мл безводного метиленхлорида. Продолжают перемешивать в течение 15 часов, после чего добавляют 200 мл воды, подкисляют добавлением разбавленной соляной кислоты, органическую фазу отделяют и водную фазу трижды экстрагируют, каждый раз используя 100 мл метиленхлорида. Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и сгущают.

Оксалат R, S-(3,4-дигидро-6,7-диметоксиизохинолин-1-ил)-2-фенил- N,N-ди-(2-(2-фторфенил)этил)-ацетамида
Смесь 29,8 г (0,049 моль) полученного на предыдущей стадии амида, 150 мл безводного метиленхлорида и 17,5 г (= 9,4 мл; 0,10 моль) хлорокиси фосфора нагревают с обратным холодильником в течение 10 часов. По окончании реакции (контроль путем тонкослойной хроматографии) реакционную смесь подают в смесь 400 мл ледяной воды и 200 мл метиленхлорида. После этого добавлением насыщенного содового раствора доводят до нейтральности, органическую фазу отделяют, а водную фазу трижды экстрагируют, каждый раз используя 100 мл метиленхлорида. Объединенные фазы сушат над сульфатом натрия и сгущают в вакууме. Остаток очищают путем хроматографии на наполненной силикагелем колонке с использованием в качестве элюента смеси метиленхлорида и метанола в соотношении 100 : 2, затем растворяют в небольшом количестве этанола и добавлением стехиометрического количества спиртового раствора щавелевой кислоты переводят в оксалат, который доводят до кристаллизации добавлением простого эфира.

Точка плавления: 144 -146^oC.

Пример 3
Оксалат (R, S)-(3,4-дигидро-6,7- диметоксиизохинолин-1-ил)-2-(4-метоксифенил)-N,N-ди-(2-(2,3,4- триметоксифенил)этил)-ацетамид
Исходные соединения:
5 г (6,57 моль) N-(2-(3,4-диметоксифенил)этил)-N'-(2-(2,3,4-триметоксифенил)-этил-диамида 4-метоксифенилмалоновой кислоты (далее: "диамид")
18 мл ацетонитрила
3,02 г (19,7 ммоль) хлорокиси фосфора
600 мг (6,66 ммоль) безводной щавелевой кислоты
200 мл простого эфира
Осуществление реакции
Реакционную смесь из "диамида", ацетонитрила и хлорокиси фосфора в атмосфере азота нагревают при температуре флегмы в течение часа. После охлаждения ледяной водой разбавляют добавлением 100 мл сложного эфира уксусной кислоты и последовательно промывают по два раза ледяной водой, 50 мл насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом магния и при размешивании выливают в раствор 706 мг (7,84 ммоль) безводной щавелевой кислоты в 200 мл абсолютного простого эфира.

Продукт отделяется в качестве соли щавелевой кислоты в виде масла, которое кристаллизуется по истечении некоторого времени в покое после размешивания. Оставляют стоять в морозильнике в течение ночи, промывают простым эфиром и сушат.

Точка плавления: 107 - 110^oC
Структуру подтверждают анализом ЯМР.

Значение R_f: 0,53 (сложный эфир уксусной кислоты)
Значение R_f: 0,6 (смесь ацетонитрила и воды в соотношении 9 : 1)
Аналогично примерам 1 - 3 получают соединения общей формулы (I), приведенные в таблицах 1 - 6.

Нижеследующие примеры поясняют получение исходных соединений.

Пример 4
А. Сложный диэтиловый эфир 4-метоксифенилмалоновой кислоты
Исходные соединения:
150 мл абсолютного этанола
7,5 г (0,33 моль) натрия
300 мл диэтилкарбоната
62,5 г (0,3 моль) сложного этилового эфира 4-метоксифенилуксусной кислоты
Осуществление реакции
Натрий растворяют в абсолютном этаноле и в вакууме упаривают досуха. К остатку при охлаждении ледяной водой и при размешивании добавляют диэтилкарбонат и сложный этиловый эфир 4- метоксифенилуксусной кислоты. Затем этанол медленно (в течение 2-3 часов) отгоняют в высоком вакууме при температуре 40 - 70^oC и 200 мм рт.ст. на колонке диаметром 40 см, снабженной кольцами Рашита. После охлаждения подкисляют добавлением 30 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 150 мл воды. Выделившееся масло промывают сперва водой, а затем насыщенным раствором хлористого натрия и сушат над сульфатом магния.

Остаток перегоняют в вакууме маслянистого насоса.

Точка кипения при 0,5 мм рт.ст.: 150 - 155^oC.

Б. Сложный моноэтиловый эфир 4-метоксифенилмалоновой кислоты
Используемые соединения:
52,2 г (0,196 моль) полученного на стадии А сложного диэтилового эфира
120 мл этанола
120 мл воды
12,3 г (0,22 моль) гидроокиси калия в 60 мл воды и 60 мл этанола
Осуществление реакции
К этанольному раствору сложного диэтилового эфира 4-метоксифенилмалоновой кислоты при перемешивании и охлаждении льдом добавляют водно-спиртовой раствор гидроокиси калия и перемешивают в течение 75 минут. После этого подкисляют насыщенным раствором лимонной кислоты и трижды экстрагируют метиленхлоридом. Органическую фазу промывают последовательно водой и насыщенным раствором поваренной соли, сушат над сульфатом магния и растворитель отгоняют в вакууме. Кристаллический остаток перекристаллизовывают из смеси метиленхлорида и простого петролейного эфира в соотношении 40 : 800.

Выход: 34,4 г (73,6% теории)
Структуру соединения подтверждена анализом ЯМР.

В. Амид сложного моноэтилового эфира N-(2-3,4- диметоксифенил)этил)- 4-метокси-фенил-малоновой кислоты
Используемые соединения:
34,4 г (0,144 моль) сложного моноэтилового эфира 4-метокси-фенилмалоновой кислоты
150 мл безводного тетрагидрофурана
23,3 г (0,144 моль) N,N'-карбонилдиимидазола
26,1 г (0,144 моль) 2-(3,4-диметоксифенил)этиламина в 50 мл безводного тетрагидрофурана
Осуществление реакции
К раствору сложного полуэфира 4-метокси- фенилмалоновой кислоты в тетрагидрофуране при перемешивании при температуре 50^oC порциями добавляют карбонилдиимидазол. Перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут, затем при охлаждении льдом добавляют амин и продолжают перемешивать при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь сгущают и остаток поглощают в метиленхлориде. Промывают по два раза водой, 10%-ным раствором кислого сульфата калия, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором поваренной соли. После сушки над сульфатом магния органическую фазу сгущают и маслянистый остаток (7,7 г) кристаллизуют из сложного эфира уксусной кислоты.

Г. N-(2-(3,4-диметоксифенил)этил)-амид 4-метокси- фенилмалоновой кислоты
Используемые соединения:
44,16 г (0,11 моль) амида сложного полуэфира 4-метокси-фенилмалоновой кислоты
300 мл метанола
120 мл (0,12 моль) 1н. натрового щелока
Осуществление реакции
К метанольному раствору амида сложного полуэфира при температуре 5 - 10^oC при перемешивании в течение 30 минут добавляют натровый щелок. Перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре, затем сгущают, разбавляют водой и дважды экстрагируют хлороформом. Водную фазу добавлением концентрированной соляной кислоты доводят до значения pH 1, и дважды экстрагируют хлороформом. Промывают насыщенным раствором поваренной соли, после чего органическую фазу сушат над сульфатом магния и сгущают. Кристаллический остаток кристаллизуют из хлороформа.

Пример 5
А. 2-(2,3,4-триметоксифенил)-1-нитро-эфир
Используемые соединения:
400 г (2,04 моль) 2,3,4-триметоксибензальдегида
1740 мл ледяной уксусной кислоты
172,6 г (2,24 моль) безводного ацетата аммония
656 мл нитрометана
Осуществление реакции
Смесь бензальдегида, ацетата аммония, нитрометана и ледяной уксусной кислоты перемешивают в атмосфере азота в течение 30 минут при температуре кипения. Затем охлаждают до температуры -5^oC и при перемешивании выливают в 5 л ледяной воды. Вязкий остаток исчерпающе экстрагируют метиленхлоридом. Органическую фазу промывают водой, сушат над сульфатом магния и сгущают. Получают 510 г коричневого маслянистого остатка, который оставляют стоять для кристаллизации. Его растворяют в 470 мл сложного эфира уксусной кислоты и добавлением 3,9 л циклогексана доводят до кристаллизации.

Б. Гидрохлорид 2-(2,3,4-триметоксифенил)этиламина
Используемые соединения:
144,5 г (0,60 моль) полученного на стадии A соединения
1,9 л воды
232 мл концентрированной соляной кислоты (абс.)
88 г 10%-ного палладия на угле
Осуществление реакции
Вышеуказанную реакционную смесь подвергают гидрированию при температуре 60^oC и давлении 35 бар в течение 2,25 часов. Затем сгущают в вакууме, остаток поглощают в этаноле и упаривают досуха. После этого растворяют в этаноле и путем добавления простого эфира продукт реакции доводят до кристаллизации.

В. 2,3,4-триметоксибензиловый спирт
Используемые соединения:
500 г (2,55 моль) 2,3,4-триметоксибензальдегида
5,0 л метанола
13,0 г окиси платины
Осуществление реакции
Восстановление осуществляют при температуре 20^oC и давлении 5 бар, и оно завершается по истечении 30 минут. После упаривания растворителя остаток (501,5 г) перегоняют в высоком вакууме (точка кипения: 116^oC, 0,5 бар).

Г. 2,3,4-триметоксибензилхлорид
Используемые соединения:
50,0 г (0,25 моль) 2,3,4-триметоксибензилового спирта
800 мл безводного метиленхлорида
59,4 г (0,5 моль) тионилхлорида
Осуществление реакции
К раствору спирта в безводном метиленхлориде при перемешивании и охлаждении смесью льда и поваренной соли медленно добавляют тионилхлорид. Продолжают перемешивать при охлаждении в течение 15 минут, затем перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель и избыточный тионилхлорид удаляют в вакууме, остаток поглощают в метиленхлориде и последовательно встряхивают с насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором поваренной соли. Сушат над сульфатом магния, после чего растворитель удаляют в вакууме и остаток подвергают перегонке в вакууме масляного насоса (точка кипения 118^oC, 0,1 мбар).

Д. 2,3,4-триметоксибензилцианид
Используемые соединения:
75,8 г (0,35 моль) 2,3,4-триметоксибензилхлорида
700 мл безводного ацетона
3,45 г (0,023 моль) йодида натрия
25,7 г (0,53 моль) сухого цианида натрия в виде порошка
Осуществление реакции
Реакционную смесь, состоящую из вышеуказанного бензилхлорида, йодида натрия и цианида натрия в безводном ацетоне, размешивают при температуре кипения в течение 20 часов. После охлаждения отсасывают и растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в сложном эфире уксусной кислоты, затем встряхивают сперва с водой, затем с насыщенным раствором поваренной соли и сушат над сульфатом магния. После удаления растворителя остаток перегоняют при давлении 0,015 мбар (точка кипения: 135^oC).

Е. 2,3,4-триметоксифенилуксусная кислота
Используемые соединения:
138,5 г (0,67 моль) 2,3,4-триметоксибензилцианида
53,5 г (1,34 моль) гидроокиси натрия, растворенной в 215 мл воды
Осуществление реакции
Смесь вышеуказанного бензилцианида и водного натрового щелока перемешивают при температуре флегмы в течение 7 часов. После охлаждения подкисляют добавлением 6н. серной кислоты и трижды экстрагируют метиленхлоридом. Органическую фазу промывают водой и насыщенным раствором поваренной соли, после чего сушат над сульфатом магния. После удаления растворителя остаток растворяют в 200 мл метиленхлорида и добавлением 1500 мл циклогексана доводят до кристаллизации.

Ж. 2,3,4-триметоксифенил-N-(2-(2,3,4-триметоксифенил)этил)-амид уксусной кислоты
Используемые соединения:
72,4 г (0,32 моль) 2,3,4-триметоксифенилуксусной кислоты
400 мл безводного тетрагидрофурана
51,8 г (0,32 моль) N,N'-карбонилдиимидазола
79,3 г (0,32 моль) гидрохлорида 2-(2,3,4-триметоксифенил)этиламина
500 мл безводного тетрагидрофурана
32,4 мл (0,32 моль) триэтиламина
Осуществление реакции
Фенилуксусную кислоту, растворенную в безводном тетрагидрофуране, путем добавления порциями N, N'- карбонилдиимидазола при температуре 5^oC и при перемешивании переводят в имидазолид. По истечении 30 минут при комнатной температуре и при перемешивании добавляют суспензию гидрохлорида вышеуказанного амина и триэтиламина в безводном тетрагидрофуране. По истечении 16 часов сгущают в вакууме и остаток распределяют между метиленхлоридом и 2 н. соляной кислотой. Затем последовательно промывают водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и насыщенным раствором поваренной слои. Сушат над сульфатом магния, после чего органическую фазу сгущают, остаток растворяют в 200 мл сложного эфира уксусной кислоты и полученный продукт доводят до кристаллизации путем добавления 700 мл циклогексана.

3. Гидрохлорид ди-2-(2,3,4-триметоксифенил)этиламина
Используемые соединения:
113,4 г (0,27 моль) полученного на предыдущей стадии амида фенилуксусной кислоты
470 мл безводного тетрагидрофурана
270 мл (0,54 моль) BH₃•S(CH₃)₂ в тетрагидрофуране (2 моль на л)
Осуществление реакции
К раствору амида кислоты в безводном тетрагидрофуране при температуре 65^oC в атмосфере азота каплями добавляют смесь указанного комплекса борана и тетрагидрофурана. После окончания добавления продолжают перемешивать при температуре 65^oC в течение 15 минут. Затем реакционную смесь охлаждают до температуры 5^oC. Осторожно подкисляют добавлением метанольной соляной кислоты, сгущают в вакууме и остаток кристаллизуют из этанола с добавлением простого эфира.

Пример 6
N-(2-(3,4-диметоксифенил)этил)-N'-(2-(2,3,4- триметоксифенил)этил)-ди-амид-4-метокси-фенилмалоновой кислоты
Используемые соединения:
3,73 г (10 ммоль) полуамида 4-метокси- фенилмалоновой кислоты
25 мл безводного тетрагидрофурана
1,62 г (10 ммоль) N,N'-карбонилдиимидазола
4,1 г (10 ммоль) гидрохлорида ди-2-(2,3,4-триметоксифенил)этиламина
40 мл безводного тетрагидрофурана
1,01 г (10 ммоль) триэтиламина (= 1,39 мл)
Осуществление реакции
К раствору вышеуказанного моноамида в тетрагидрофуране при температуре 5^oC при перемешивании порциями добавляют карбонилдиимидазол. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем при охлаждении льдом подвергают взаимодействию с суспензией гидрохлорида амина в тетрагидрофуране и триэтиламине. Размешивают при комнатной температуре в течение 16 часов, затем сгущают и остаток растворяют в сложном эфире уксусной кислоты. Органическую фазу последовательно промывают водой, 5%-ным раствором кислого сульфата калия, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и ненасыщенным раствором поваренной соли. После сушки над сульфатом магния сгущают и остаток (7,2 г) очищают путем хроматографии на 210 г силикагеля с использованием в качестве элюента смеси сложного эфира уксусной кислоты и н-гексана в соотношении 2 : 1.

Нижеследующие опыты поясняют действие новых производных дигидропиридина и заявленное применение известных производных дигидропиридина в новых целях.

В этих опытах исследовались приведенные в таблицах 7 - 14 соединения.

Как уже указывалось, соединения общих формул (I) и (II) можно применять в качестве средств для терапии хронических воспалительных процессов, язвенного колита и болезни Крона, а также в качестве тормозящих размножение клеток средств. Причиной действия этих соединений является блокировка неселективных катионных каналов (далее: НКК).

В основе патофизиологии хронической бронхиальной астмы лежат воспалительные процессы, которые вызваны активацией воспалительных клеток (см. Barnes, 1987 г., Seiffert и Schultz, 1991 г.).

Регулируемая рецепторами активация воспалительных клеток (например, нейтрофильных гранулоцитов и тучных клеток или их постоянных клеточных линий HL-60 или сенсибилизованных, то есть нагруженных гаммаглобулином E клеток RBL [RBL = rat basophilic lymphoma (базофильная лимфозома крысы)]) ингибируются независимо от вида стимулирующего агониста (например, эндотелии, ФАТ [фактор активации тромбоцитов], лейкотриены, хемотактичный пептид fMLP или антиген против сенсибилизованных тучных клеток) блокаторами НКК (см. Rink, 1990 г.). По этим каналам внеклеточный кальций попадает в клетки, что необходимо для постоянства активации клеток, происходящей по посредничеству рецепторов (см. Putney, 1990 г.). Если этот переход кальция прерывается, то блокируется активации воспалительных клеток.

Классические антагонисты кальция типа дигидропиридина или фенилалкиламина не ингибируют ни НКК, ни воспалительные процессы (см. Wells и др., 1986 г.).

Для оценки активации клеток или для оценки ее ингибирования блокерами НКК измеряли фторометрически кинетику концентрации кальциевых ионов в цитоплазме клеток, нагруженных Fura-2, по методу, описанному Grynkiewicz и др. (1985 г. ). Этот метод оправдал себя как надежный метод скрининга для выявления блокаторов НКК в рамках данной заявки.

Для определения специфической характеристики блокаторов НКК пригодно т. н. функциональное ингибирование Тапсигаргином. Тапсигаргин представляет собой описанный Thastnip и др. (см. Proc.Natl.Acad.Sci. (США), 87, стр. 2466-2470, 1990 г. ) промотор опухолей, который избирательно и необратимо тормозит Ca²⁺ -переносящую АТР-азу внутриклеточных, чувствительных относительно IP₃ складов Ca²⁺. Это приводит к быстрому опорожнению складов Ca²⁺ Как описывает J. Putney (см. Calcium, 11, стр. 611 - 624, 1990 г.), опорожнение этих складов представляет собой физиологический сигнал для открытия НКК в мембране клетки. Вследствие этого в клетки вливается большое количество Na⁺ и Ca⁺. Благодаря этим свойствам тапсигаргин является пригодным для косвенной стимуляции независимого от агонистов и IP₃ открытия НКК.

В рамках настоящего изобретения стимуляцию НКК тапсигаргином успешно осуществляли на клетках HL 60 (лейкозных клетках человека), нервных клетках гиппокампа и коры головного мозга и клетках RBL и таким образом подтвердили наличие этих каналов в соответствующих клеточных линиях.

Концентрация Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) в цитоплазме играет важную роль при размножении клеток и росте опухолей (обзор см. L. R. Zacharski, Journal of Medicine, 19, стр. 145 - 177, 1988 г.). Полагают, что в частности переход Ca²⁺ в клетку, поощряемый активацией рецепторов с последующим посредничеством трифосфата инозитоля и IP₃, имеет решающее значение при онкогенном размножении клеток (см. U. Kikkawa и Y. Nishizuka, Ann. Rev. Cell. BioL, 2, стр. 149 -178, 1986 г. ). Этот механизм играет роль и при образовании метастаз и устойчивости ко многим лекарствам (обзор см. вышеуказанный источник L. R. Zacharski, J. Med., 19, стр. 145 -177, 1988 г.).

Эта гипотеза подтверждается тем, что тапсигаргин как средство косвенной стимуляции НКК приводит к перегрузке клеток кальциевыми ионами, и, кроме того, он является высокоэффективным промотором опухолей (см. V. Thastrup и др. , Proceedings of the Natl. Acad. Sci. (США), 87, стр. 2466 - 2470, 1990 г.).

Блокировка перехода Ca²⁺ в клетки через НКК приводит к нормализации внутриклеточной концентрации кальциевых ионов и, таким образом, к торможению роста опухолей и т.п.

Классические антагонисты кальция не ингибируют НКК. Неожиданно выявили, что соединения согласно изобретению ингибируют переход кальция в клетки через НКК.

Как показали S. Н. Murch и др. (см. Lancet, 339, стр. 381 - 385, 15-го февраля 1992 г.), важную патофизиологическую роль в воспалительных заболеваниях кишечника, например, язвенном колите и болезни Крона, играют эндотелии I. С помощью иммуногистохемических методов выявили, что пациенты, больные болезнью Крона в области подслизистой оболочки, и пациенты, больные язвенным колитом в области передней пластинки эпителии толстого кишка, обладают заметно и сильно повышенной концентрацией эндотелина 1 по сравнению со здоровыми людьми. Полагают, что локальное выделение эндотелина вызывает сильные вазоспазмы с последовательной рассеянной ишемией с микроинфарктами, которые, наверно, представляют собой действительную причину указанных заболеваний. Вазоспазмогенное действие эндотелина объясняют перегрузкой васкулярных миоцитов кальциевыми ионами. При этом эндотелин в первую очередь вызывает внутриклеточное выделение Ca²⁺, посредником которого является IP₃, после чего происходит сильный трансмембранный переход Ca²⁺ через нечувствительные в отношении дигидропиридина каналы (см. М. S. Simonson и др., Clin. Invest. Med., 14, стр. 499 - 507, 1991 г.; Т. Masakai, J. Cardiovasc. PharmacoL, 13, Suppi. 5, S1 - S4, 1989 г.; D. W. Hay, R. J. PharmacoL, 100, стр. 383 -392, 1990 г.). Эти каналы представляют собой НКК, наличие которых также в клетках мукозы толстой кишки было обнаружено недавно (см. Chr. Siemer и Н. Gogelein, Europ. J. Physiol., 420, стр. 319-328, 1992 г.).

В качестве пригодной модели скрининга для обнаружения функциональных антагонистов эндотелина оправдала себя поощряемая эндотелином активация нагруженных Fura-2 лейкозных клеток человека (клеток HL 60). Подобно G. Grynkiewicz и др. (см. J. Biol. Chem., 260, стр. 340 - 3450, 1985 г.), внутриклеточную концентрацию кальциевых ионов в цитоплазме клеток HL 60 (в суспензии) можно наблюдать путем спектрофлуометрии и количественно определять в качестве меры активации клеток эндотелином. Стимуляцию осуществляли путем добавления 0,1 мкмоль эндотелина, и она поддавалась зависимому от дозы ингибированию соединениями согласно изобретению.

Функциональный антагонизм соединений согласно изобретению против эндотелина действует через блокаду НКК. Поэтому подтверждение функционального антагонизма против тапсигаргина на клетках RBL-hm1 пригодно в качестве метода скрининга функциональных антагонистов эндотелина.

Осуществление исследования
Для скрининга нагруженные Fura-2 связанные клетки RBL-hm1 в свободной от кальциевых ионов среде инкубации стимулируют добавлением 0,1 мкмоль тапсигаргина. По истечении 4 минут добавляют внутриклеточные кальциевые ионы до количества 1,5 ммоль и с помощью флуоресценции Fura-2 определяют сильное повышение концентрации кальциевых ионов в цитоплазме, обусловленное сильным трансмембранным притоком Ca²⁺ через НКК.

Данный приток можно исключительно и в зависимости от дозы ингибировать с помощью блокеров НКК. Ни классические антагонисты против кальция, ни специфические блокеры агонистов, стимулирующие обновление IP₃, не пригодны для торможения косвенно вызванного тапсигаргином трансмембранного притока кальциевых ионов. Соединения согласно изобретению отличаются ингибированием НКК.

Флуорометрическое измерение кальция в цитоплазме отдельных связанных клеток RBL-2H3 осуществляли аналогично описанному Kudo и Ogura (1986 г.) методу для нервных клеток. Применяли флюроесцентный микроскоп AXIOVERT 35 фирмы Zeiss в сочетании с имиджинг-системой Hamamatsu, состоящей из системы обработки изображения, камеры с контролирующим узлом и усилителя изображения DVS 3000.

Кинетика цитоплазматической концентрации Ca²⁺ выражается в виде кривой "концентрация - время" по активации клеток, вызываемую 0,1 мкмоль тапсигаргина. Сравниваются кривые двух активированных культур клеток в присутствии и отсутствии 10 мкмоль исследуемого соединения. Площадь ниже этих кривых (ПНК) измеряется суммарно и является мерой активации клеток. Интенсивность ингибирующего действия исследуемых блокеров НКК определяется по следующему уравнению:

причем % Т - торможение в процентах прохода кальция через НКК, который стимулируется и ингибируется 10 мкмоль исследуемого соединения;
ПНК_ИНГ - площадь под кривой, которая получена в присутствии стимулятора плюс 10 мкмоль ингибирующего исследуемого соединения;
ПНК_КОНТР. - площадь под кривой, полученной лишь в присутствии стимулятора.

Результаты измерений
Определяют торможение в процентах НКК в клетках RBL-hm1 после стимуляции с использованием 0,1 мкмоль тапсигаргина. Исследуемые соединения без исключения использовали в концентрации 10^-5моль.

Исследуемые соединения и их действие приведены в таблице 15.

Функциональное противовоспалительное действие можно показать путем нижеследующего опыта.

Используют отдельные клетки RBL-2H3 (родной тучным клеткам линии опухолевых клеток), прилипающие к стеклянным пластикам.

Культивацию клеток RBL-2H3 осуществляют по методу, описанному Hide и Beaven (1991 г.). Для сенсибилизации прилипших клеток RBL-2H3 клетки инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре в среде имеющегося в торговле раствора гаммаглобулина E (степень разбавления 1 : 2000) в присутствии комплекса динитрофенола и альбумина бычьей сыворотки. Затем клетки промывают. Добавлением 0,1 мл раствора динитрофенола и альбумина бычьей сыворотки (10 мкг/мл) вызывают сильную имуннологическую активацию клеток, посредником которой является перегрузка цитоплазмы кальциевыми ионами. Флуорометрическое определение кальция в цитоплазме отдельных прилипших клеток RBL-2H3 осуществляют аналогично приведенному выше методу, описанному Kudo и Ogura (1986 г.) в связи с нервными клетками.

В качестве сравнительного соединения в данном опыте служит 10 мкмоль хромоглицата, приводящего примерно к 50%-ному торможению индуцированной антигеном активации клеток.

В данном контрольном опыте указанные соединения проявляют выраженное в % торможения действие, сравнимое с указанными величинам.

В опытах, проведенных на микрокультурах разных опухолевых клеточных линий человека с помощью опыта тетразолия для определения тормозящего размножение действия предлагаемых соединений неожиданно выявилось, что действие исследуемых соединений 5 до 100 раз превышает действие сравнительного вещества верапамил.

Тормозящее размножение действие исследуемых соединений исследовали с помощью опыта МТТ [МТТ = бромид 3-(4,5 -диметилтиазол-2- ил)-2,5-дифенил-тетразолия] фирмы Chemicon Inc. (г. Эль Сегундо, США), описанного Mosmanin (J. Immunol. Meth., 65, стр. 55 - 63, 1983 г.), Denizot и др. (J. Immunol. Meth. , 89, стр. 271 -277, 1986 г.), и J. Eliason др. (Int. J. Cancer, 46, стр. 113 - 117, 1990 г.). Данный индикатор лишь живыми клетками с неповрежденными митохондриями метаболизуется с получением синего продукта формазан. В нашем опыте использовали следующие опухолевые клеточные линии человека: А 549 (аденокарциномы легких), А 431 (карцинома эпидермы вульвы), PC 3 (аденокарциномы простаты), SK BR 3 (аденокарциномы молочной железы), НТ 29 (СХ1 1) (аденокарциномы ободочной кишки) и К 562 (хронически-миелоическую лейкозную клетку). Для проведения опыта использовали микротитровые пластинки. В каждое углубление подали 100 мкл клеточной суспензии (0,2 • 10⁶ клеток на мл). В качестве среды инкубирования служило RPMI 1640, содержащее 10% дезактивированной теплотой эмбриональной сыворотки телят и 50 мкг/мл гентамицина. Клеточные суспензии инкубировали в течение 0, 24, 48 или 72 часов при насыщенном влагой воздухе в смеси 5% двуокиси углерода и 95% воздуха при температуре 37^oC, в присутствии и отсутствии разных концентраций тормозящих размножение соединений. Последние растворяли в диметилсульфоксиде с конечным разбавлением 0,1%. Затем добавляли 10 мкл раствора МТТ (3 мг/мл) и, по истечении 3 часов, 100 мкл содержащего 0,08 н. соляную кислоту раствора изопропанола. По истечении дальнейшего часа определяли абсорбцию света при 570 нм (сравнительная длина волн 630 нм) в подходящем счетчике. Абсорбция света является прямо пропорциональной количеству живых клеток. Полумаксимальные концентрации торможения исследуемых соединений составляли примерно 1 мкг/мл.

Вазоспазмолитическое действие вышеуказанных функциональных антагонистов эндотелина или тапсигаргина подтверждали на изолированном сосуде. На ретроградно перфундированных, спонтанно бьющихся сердцах крыс по Лангендорффу непрерывно измеряли коронарную перфузию с помощью электромагнитного прибора измерения потока (прибор фирмы Hugo Sachs Elektronik, г. Mapx, DE). Данный опыт позволяет с высокой точностью определять размер, продолжительность и вид спазмов в сосудах. Если перфундировать при концентрации эндотелина 100 нмоль, то коронарный поток перфузии сокращается с 11 до 5 мл/мин. Сокращение перфузии можно снять добавлением соединений согласно изобретению. Сила действия соединений согласно изобретению относительно торможения тапсигаргина на нагруженных Fura-2 клетках RBL-hm1 или эффективности торможения эндотелина на нагруженных Fura-2 клетках HL 60 однозначно коррелировало с подтвержденным на препарате по Лангендорффу вазоспазмолитическим действием исследуемых соединений. Из этого можно делать вывод, что в основу вазоспазмолитического антагонизма эндотелина исследуемых соединений лежит блокада НКК.

Источники информации
Barnes P. J. , 1. W. Rodger и N. C. Thomson, Pathogenesis of asthma, в Asthma, basic mechanisms and clinical management, под ред. P. J. Barnes, издательство Academic Press, Лондон, 1988 г.

Grynkiеwicz, G., M. Poenie и R. Y. Tsien, A new generation of Ca²⁺-indicators with greatly improved fluorescence properties, J. Biol. Chem., 260, стр. 3440 - 3450, 1985 г.

Hide, M. и M. A. Beaven, Calcium influx in a rat mast cell (RBL- 2H3) line, J. Biol. Chem., 266, стр. 15221 -15229, 1991 г.

Kudo, Y. и A. Ogura, Glutamate-induced increase in intracellular Ca²⁺-concentration in isolated hippocampal neurones, Br. J. Pharmacol., 89, стр. 191 - 198, 1986 г.

Putney, J. W. младший, Capacitative Calcium entry revised, Cell Calcium, 11, стр. 611- 624,1990 г.

Rink, T. J., Receptormediated calcium entry, Fes. Lett., 2686, стр. 381 -385,1990 г.

Seifert, R. и G. Shultz, The superoxide forming NADPH oxidase of phagocytes: An enzym system regulated by multiple mechanism, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., том 117, издательство Springer Verlag, 1991 г.

Wells, E. , С. G. Jackson, S. T. Harper, J. Mann и R. P. Eaoy, Characterization of primate bronchalveolar mast cells II, inhibition of histamine, LTC₄ and PGF_2alfa release from primate bronchoalveolar mast cells and a comparison with rat peritoneal mast cells, J. Immunol., 137, стр. 3941 - 3945, 1986 г.

Объектом изобретения являются производные анеллированного дигидропиридина общей формулы I,

где А - бензо- или тиеногруппа;
R² - гидроксил, алкоксил, бензилокси, галоген; алкил;
m - 0, если А - тиеногруппа и 2, если А - бензогруппа;
R¹ -- С_4-6 циклоалкил или группа формулы II,

где R⁵ - алкил, азидогруппа, галоген, алкоксил;
n = 1, 2 или 3, n = 0, если А - тиеногруппа;
R³ и R⁴ - водород, C_3-6 алкенил, C_3-6 - алкинил, С_1-12-алкил, который может быть замещен тиенилом или фенилом, или R³ - водород, R⁴ - циклогексил, фенил, фторфенил, пиридил или N-бензилпиперидил или R³ и R⁴ вместе с атомом азота образуют пирролидинил, пиперидинил, группу формулы III
,
или пиперазинил, незамещенный или замещенный, например группой формулы IV

или их соли с физиологически переносимыми кислотами. Предложено также средство, блокирующее неселективные катионные каналы, где в качестве активного вещества используют соединение формулы I или его соль с физиологически переносимой кислотой. 2 с.п. ф-лы, 15 табл.

1. Производные анеллированного дигидропиридина общей формулы I

где A - означает бензо- или тиеногруппу;
заместители R², независимо друг от друга, означают гидроксил, алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, бензилоксигруппу, галоген, алкил с 1 - 4 атомами углерода;
m - 0, если A представляет собой тиеногруппу, и 2, если A означает бензогруппу;
R¹ - циклоалкил с 4 - 6 атомами углерода, циклоалкилалкил с 4 - 6 атомами углерода в циклоалкильной части и 1- 5 атомами углерода в алкильной части, или группа формулы

где R⁵ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, азидогруппу, галоген, алкоксил с 1- 4 атомами углерода;
n равно 1, 2 или 3, причем n может быть равно 0 в том случае, если A означает тиеногруппу;
R³ и R⁴ независимо друг от друга означают водород, неразветвленный или разветвленный алкенил с 3 - 6 атомами углерода, неразветвленный или разветвленный алкинил с 3 - 6 атомами углерода, неразветвленный или разветвленный алкил с 1 - 12 атомами углерода, причем алкил может быть замещен тиенилом или фенилом, причем фенил может быть моно-, ди- или тризамещен алкилом с 1 - 4 атомами углерода, азидогруппой, алкоксилом с 1 - 4 атомами углерода, бензилоксигруппой, галогеном, трифторметилом, адамантилом, группой -SO₂NH₂, или -O-CH₂-O-, пиридилом, пирролидинилом, N - метилпирролидинилом, морфолиногруппой, адамантилом, нитрилогруппой; или R³ - водород, а R⁴ - циклогексил, фенил, фторфенил, пиридил или N -бензилпиперидил; или R³ и R⁴ вместе с атомом азота, с которым они связаны, означают пирролидинил, пиперидинил, группу формулы

или пиперазинил, незамещенный или замещенный у атома азота метилом, незамещенным фенилом, моно- или диалкоксифенилом с 1 - 4 атомами углерода в каждой алкоксильной части, пиримидинилом, фенилалкилом с 1 - 4 атомами углерода в алкильной части или группой формулы

или их соли с физиологически переносимыми кислотами. 2. Средство, блокирующее неселективные катионные каналы, содержащее активное вещество, отличающееся тем, что в качестве активного вещество содержит соединения формулы I по п.1 или его соль с физиологический переносимой кислотой.