СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Данное изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунологии бактериальных инфекций и предназначено для ранней диагностики дифтерии у детей и иммунологического мониторинга в процессе лечения и может быть использовано в клинической практике.

Значительное ухудшение в 90-е годы эпидемической обстановки заболеваемости дифтерией, увеличение частоты тяжелых токсических форм, приводящих нередко к неблагоприятным исходам, а также регистрация случаев атипичного течения локализованных форм дифтерии среди привитых детей, диктует необходимость совершенствования методов лабораторной диагностики этой инфекции, поиска более информативных методических подходов, создания чувствительных и специфических диагностических препаратов.

Важное значение в этом аспекте приобретает определение дифтерийного токсина /ДТ/, как основного поражающего фактора при дифтерии, в биосубстратах от больных. Известен способ выявления ДТ методом иммуноферментного анализа /ИФА/, для постановки которого применяется набор ингредиентов концерна "Иммуноген", НПО "Биомед", иммуноферментная тест-система для выявления антигенов ДТ /Майкоп/. /Цыганова И.В., Паранук З.Ш., Хшитова Н.С. и др., Клинич. лаб. диагностика N 1 1995, с. 31 - 33/. Учет результатов иммуноферментной реакции проводится визуально. Авторами предложенного метода ДТ определялся в бульонных культурах, получаемых после посева материала из зева и носа больных на среду /кровяно-теллуритовый агар/, а также на содержание ДТ исследовались сыворотки крови больных дифтерией. В результате, из 773 подозрительных на дифтерию бульонных культур только 70 дали положительные результаты ИФА, а из 25 сывороток крови - 5. Это позволяет судить о низкой чувствительности метода и ограниченности его использования для диагностических целей. К тому же, метод требует специального оборудования и больших затрат времени для проведения подготовительных мероприятий перед постановкой ИФА /посев на среду материалов из зева и носа - 24 - 28 часов, отсев на бульон Мартена и выращивание в течение 18 - 20 часов/. Результат лабораторного обследования больных этим методом можно получить только на 3 день после забора материала, что значительно замедляет процесс диагностики дифтерии и не позволяет использовать названный выше метод для экспресс-диагностики этой инфекции.

Для ускорения процедуры лабораторного подтверждения дифтерии определение ДТ проводят в сыворотках крови больных методом ИФА с использованием тест-системы производства НИИ вакцин и сывороток г. Пермь на основе F(ab)₂-фрагментов чистых противодифтерийных антител /Шабалина С.В., Райхер И.И., Райхер Л.И. и др., ЖМЭИ N 8 1987, с. 82 - 85; Никитюк Н.М., Смурова Л. Ю., Шабухова Т.С. и др., ЖМЭИ N 9 1990, с. 67 - 69/. Положительным контролем в иммуноферментной реакции служит ряд разведений очищенного дифтерийного анатоксина. Учет результатов происходит визуально по появлению в лунках коричневого окрашивания различной интенсивности. Исследование сывороток крови 52 больных с различными клиническими формами дифтерии при помощью вышеназванного метода показало, что частота обнаружения ДТ составила 100% только при субтоксических и токсических формах. При локализованных формах ДТ обнаруживается только в 41,3% случаев. В контрольной группе здоровых детей ДТ не выявлялся ни в одном случае, что подчеркивает специфичность используемого метода с одной стороны, но и его недостаточную чувствительность - с другой. Своевременная дифференциальная диагностика локализованных форм дифтерии, как наиболее часто встречающихся среди привитых детей, заболевших дифтерией, основанная только на особенностях клинических проявлений дифтерийной интоксикации, весьма затруднена и требует быстрого лабораторного подтверждения. Это не позволяет достигнуть использование вышеуказанного диагностического теста. В настоящее время, также, остается дискутабельным вопрос циркуляции свободного ДТ в кровяном русле, что заставляет усомниться в информативности данных, получаемых при исследовании сывороток крови на содержание в них свободного ДТ. Поэтому отсутствие или наличие ДТ в сыворотке крови, отмечаемое данным методом, еще не позволяет сделать окончательный вывод о состоянии токсинемии организма больного. К тому же, авторы вышеназванного иммуноферментного набора не исключают возможность наличия ложноположительных реакций за счет присутствия противовидовых иммуноглобулинов в сыворотке крови. Кроме того, во фракции ИГG даже у гипериммунного организма антител определенной специфичности содержится не более 20% /Райхер И.И., 1973/. Таким образом этот способ не отвечает современным представлениям о патогенезе дифтерии и не позволяет провести дифференциальную диагностику локализованных форм дифтерии в 100% случаев, что может отразиться на своевременности проводимых терапевтических мероприятий по специфической детоксикации организма.

Устранить недостатки, характерные для указанных выше диагностических тестов, позволит предлагаемый авторами настоящего изобретения метод количественного определения ДТ в составе циркулирующих иммунных комплексов с помощью иммуноферментного анализа. Проблеме излучения циркулирующих иммунных комплексов /ЦИК/ в современной клинической иммунологии уделяется большое внимание. Определение составляющих компонентов ЦИК - антигена или антитела - является весьма перспективным направлением в дифференциальной диагностике инфекционных заболеваний. Синтез специфических антител против антигенов возбудителя или факторов его патогенности - токсинов, формирование иммунных комплексов является обязательным компонентом нормального иммунного ответа, что приводит к снижению циркулирующих антигенов и может существенно искажать данные традиционных методов исследования, в частности и вышеназванных методов.

Авторами впервые сконструирован диагносический тест, основанный на известных методических приемах, позволяющий определить количественный уровень ДТ в составе ЦИК из сыворотки крови детей, больных разными формами дифтерии ротоглотки, что значительно улучшит не только диагностику дифтерии, но и иммунологический мониторинг в процессе лечения.

В основу предлагаемого способа экспресс-диагностики дифтерии положен следующий принцип обнаружения составляющих компонентов специфических ЦИК: 1. Осаждение ЦИК из сывороток крови больных с помощью ПЭГ 6000; 2. Разрушение /диссоциация/ иммунных комплексов нагреванием на водной бане; 3. Определение антигенов возбудителя с использованием высокоспецифичных диагностикумов. Для работы авторами изобретения использовалась тест-система "Дифтерия-монозим", производства НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова /Москва/, предназначенная для иммуноферментного определения ДТ при помощи моноклональных антител с COOH-концевому участку молекулы токсина.

Разработанный авторами способ диагностики разных форм дифтерии осуществляется следующим образом: из свежей сыворотки крови больного проводят осаждение ЦИК по Digeon с использованием 3,5% ПЭГ 6000 /"Serva"/. Для этого к 0,1 мл исследуемой сыворотки добавляют 4,9 мл охлажденного 3,5% раствора ПЭГ, приготовленного на боратном буфере pH 8,5 - 8,7. Смесь инкубируют при t 4^oC в течение 16 - 18 часов, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а ПЭГ-преципитат растворяют в 0,3 мл Na-фосфатного буфера pH 7,4 ± 0,1 в течение 1 часа при комнатной температуре. Диссоциацию комплектов антиген-антитело /АГ-АТ/ проводятся нагреванием образцов на водяной бане при t + 98^oC в течение 10 минут. Охлажденные опытные образцы вносят в лунки 96-луночного планшета, подготовленного для постановки иммуноферментной реакции согласно инструкции по применению набора "Дифтерия-монозим" /предварительно наносятся на планшет моноклональные антитела к COOH-концевому участку молекулы токсина/. Продолжительным контролем при постановке иммуноферментной реакции служит ряд серийных двукратных разведений очищенного дифтерийного анатоксина с активностью 300 Lf/мл и исходным разведением 1: 4000. Отрицательным контролем реакции служит среда культивирования нетоксигенного штамма дифтерийного микроба. После инкубации нанесенных образцов при t 37^oC в течение 1 часа и трехкратной отмывки планшета 0,9% раствором хлорида натрия с ТВИН-20 антиген /ДТ/ выявляют с помощью очищенных лошадиных антитоксических антител, меченых пероксидазой хрена. Субстратом в реакции служит 5-амино-салициловая кислота с 0,05% раствором H₂O₂. Реакцию оценивают после 30 минут инкубации при комнатной температуре путем измерения величины оптической плотности при длине волны 450 нм на фотометре планшетного типа "Яхонт" /НПО "Проба", С-Петербург/. Используемая тест-система отвечает требованиям чувствительности, если положительная реакция /коричневое окрашивание/, оцененная при помощи фотометра, выявляется в лунке, содержащей анатоксин в разведении не ниже 1: 128000 /концентрация анатоксина 0,002 Lf/мл. Величину оптической плотности, не достигающую порога чувствительности тест-системы или равную ей /меньше 0,002 Lf/мл и 0,002 Lf/мл соответственно/, расценивают как негативный результат реакции. Концентрацию ДТ в опытных образцах устанавливают по калибровочной кривой /в единицах активности Lf/мл/ с учетом разведения сыворотки крови и ПЭГ-преципитата. Положительный результат реакции является основанием для подтверждения или установления диагноза "Дифтерия".

При постановке опыта проводят контроль специфичности сорбции конъюгата и контроль субстрата. В специальном опыте авторы проводили параллельное тестирование ДТ в необработанных нагреванием образцах. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, в шести опытах из восьми ДТ в составе ЦИК без диссоциации последних не выявлялся, в двух других опытах ДТ выявляется в меньших количествах, чем в образцах, обработанных нагреванием.

Таким образом, процесс определения ДТ в составе ЦИК предлагаемым методом с момента забора крови до последнего этапа ИФА занимает в целом 24 часа.

Предлагаемым методом авторами было обследовано 273 образца сыворотки крови детей, больных различными формами дифтерии ротоглотки: локализованной - 20, распространенной - 7, субтоксической и токсической - 19 человек, группу носителей токсигенных коринебактерий дифтерии /ТКД/ составляли 24 ребенка. В контрольную группу вошли здоровые дети /4 чел./, больные лакунарной ангиной /4 чел. / и вирусным энцефалитом /4 чел./. Уровень ДТ определяли в разных этапах инфекционного процесса: до лечения антитоксической противодифтерийной сывороткой /АПДС/ - 1 - 6 день болезни - и после лечения с недельными интервалами.

При исследовании сывороток крови детей контрольной группы ни в одном случае не был выявлен ДТ, что подтверждает специфичность используемого метода. Результаты исследований сывороток крови детей с разными формами дифтерии представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, уровень ДТ при разных клинических формах дифтерии варьирует в довольно широком диапазоне концентраций: от 0,45 до 22,3 Lf/мл. В острую фазу инфекционного процесса /1 - 6 сутки болезни/ у 52% детей с локализованными формами дифтерии концентрация ДТ составляет в среднем 1,07 ± 0,2 Lf/мл, у 60% детей с распространенными формами - 0,65 ± 0,15 Lf/мл, у 59% детей с субтоксическими и токсическими формами - 1,25 ± 0,15 Lf/мл. У длительных носителей ТКД ДТ тестировался в концентрации 1,15 ± 0,2 Lf/мл. Динамика содержания ДТ после лечения АПДС и на всех дальнейших этапах инфекционного процесса при трех клинических формах дифтерии представлена на чертеже. Сроки обнаружения ДТ в ЦИК и его уровень коррелируют с длительностью сохранения симптомов интоксикации и развитием осложнений дифтерийного процесса.

Таким образом, применение предлагаемого метода количественного определения ДТ в составе ЦИК в клинической практике позволяет, с одной стороны, провести экспресс-диагностику дифтерии в течение 24 часов, а с другой стороны, прогнозировать тяжесть течения дифтерии и оценивать эффективность проводимых терапевтических мероприятий. Преимущество этого метода перед упомянутыми выше аналогами состоит в том, что за счет выявления ДТ в составе специфических ЦИК увеличивается чувствительность способа диагностики дифтерии как такового и, следовательно, значительно возрастает достоверность получаемых результатов при использовании сывороток крови больных на содержание ДТ.

Изобретение относится к области медицины, точнее клинической иммунологии бактериальной инфекции, и предназначено для ранней диагностики дифтерии у детей и иммунологического мониторинга в процессе лечения. Способ состоит в том, что дифтерийный токсин определяют в составе циркулирующих иммунных комплексов, затем образцы, диссоциированные нагреванием, наносят на тест-систему с моноклональными антителами к СООН-концевому участку молекулы токсина и при уровне токсина 0,45 Lf/мл и выше диагносцируется дифтерия. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 3 табл., 1 ил.

Способ диагностики дифтерии у детей путем выявления дифтерийного токсина, отличающийся тем, что дифтерийный токсин определяют в составе циркулирующих иммунных комплексов, проводят их диссоциацию нагреванием и полученные образцы затем наносят на тест-систему с моноклональными антителами к СООН-концевому участку молекулы токсина и при уровне токсина 0,45 Lf /мл и выше диагностируется дифтерия.