СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА Российский патент 1999 года по МПК G01N33/577 G01N33/48 G01N33/483 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к прижизненной и постмортальной диагностике дифтерийной инфекции. Создавшаяся эпидемиологическая обстановка, наличие большого числа летальных исходов диктуют необходимость разработки упрощенных специфических методов диагностики дифтерии, приемлемых для работы широкой сети органов здравоохранения.

Весьма важное значение выявление дифтерийного токсина приобретает в научно-исследовательской работе при определении его локализации в тканях и клетках, взаимосвязи с характером патоморфологических изменений для углубленного изучения патогенеза дифтерийной инфекции.

Данный метод относится к иммуноцитохимическим методам и основан на специфической реакции антиген-антитело.

Наиболее близким к предлагаемому способу является метод выявления дифтерийного токсина прямым иммунофлюоресцентным методом в замороженных срезах миокарда (Burgh G.E. et al. Diphtheritic Myocarditis The American journal of Cardiology, 1968, v. 21, N 2). Авторы исследовали сердце трехлетней девочки, умершей от дифтерии, осложнившейся дифтерийным миокардитом. Кусочки сердечной мышцы замораживали при -70^oC в гексане и затем делали криостатные срезы толщиной 8 мкм при -30^oC.

Для выявления токсина авторы использовали очищенную лошадиную противодифтерийную сыворотку (активность 4000 МЕ/мл), разведенную в два раза в физиологическом растворе и конъюгированную с изотиоцианатом. В результате дифтерийный токсин был визуализирован в клетках в виде яркого свечения. Токсин локализовался главным образом в цитоплазме крупных мононуклеаров, а также в миокардиоцитах. Авторы отметили очаговое, неравномерное распределение дифтерийного токсина в миофибриллах. Они также обратили внимание, что в зонах некроза дифтерийный токсин не выявлялся.

Описанный метод позволил авторам выявить дифтерийный токсин в ткани, но была использована поликлональная сыворотка, содержащая кроме специфических и другие антитела, что в свою очередь уменьшает достоверность полученных результатов. Следует также отметить, что в отличие от прямого иммунофлюоресцентного непрямой иммунопероксидазный метод обладает значительно большей чувствительностью, позволяет иметь постоянные препараты, поскольку интенсивность окраски не падает. Эти препараты можно просматривать в обычном микроскопе (Дж. Полак, С.Ван-Норден, Введение в иммуноцитохимию, 1986 г.) и оценивать характер морфологических изменений.

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и достоверности способа выявления дифтерийного токсина в тканях.

Сама схема постановки иммунопероксидазной реакции известна и включает: 1 - промывка срезов или мазков в буфере, 2 - нанесение на срезы первых антител, 3 - промывка в буфере, 4 - инкубация срезов в растворе вторых антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой, 5 - промывка в буфере, 6 - обработка 0,03%-ным раствором диаминобензидина, 7 - докраска гематоксилином, 8 - заключение в бальзам. Но, как показывают данные литературы и личный опыт, приведенная схема лишь в общем виде отражает ход постановки методики. В зависимости от природы выявляемого антигена необходима детальная обработка всех этапов, начиная от фиксации и до нанесения диаминобензидина.

Так, проведенные исследования показали, что для выявления дифтерийного токсина: 1) приемлемы лишь криостатные срезы исследуемых органов, 2) не рекомендуется фиксация мазков и срезов в формалине, 3) в качестве первых антител необходимо исследование только моноклональных антител к дифтерийному токсину, 4) отмечено, что перед нанесением вторых антител, конъюгированных с пероксидазой, необходима обработка мазков и срезов в растворе бычьего сывороточного альбумина.

Предложенный впервые комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммунопероксидазного выявления дифтерийного токсина, является обязательным. Невыполнение их не дает объективных результатов, не позволяет провести соответствующую интерпретацию для постановки диагноза.

Анализ известных опытов на дату заявки показывает, что не существует подобных способов, позволяющих выявлять дифтерийный токсин в мазках и гистологических срезах.

Это позволяет нам сделать вывод о существенном отличии заявляемого способа.

Описание способа.

1. Фиксация криостатных срезов толщиной 10 мкм в ацетоне в течение 15 мин. Мазки со слизистой зева, полости носа также фиксируются в ацетоне 10 мин.

2. Промывка в фосфатно-солевом буфере (pH - 7,2) в течение 20 мин.

3. Нанесение на срезы и мазки моноклональных антител к дифтерийному токсину (производство фирмы "Илья Мечников") в разведении 1:30. Инкубация при температуре 37^oC 45 мин.

4. Промывка в двух порциях фосфатно-солевого буфера по 5 мин.

5. Инкубация в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина 20 мин.

6. Нанесение на срезы и мазки антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой. Рабочий титр подбирается опытным путем.

7. Промывка в трех порциях фосфатно-солевого буфера по 5 мин.

8. Обработка материала в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидинтетрахлорида (ДАБ) и 0,025% перекиси водорода в течение 5 мин.

9. Слабая докраска гематоксилином.

10. Заключение в бальзам.

Продукт реакции при экспериментальном дифтерийном миокарде у 5 кроликов выявлялся в клетках исследованных органов (сердце, легкие) в виде светло- и темно-коричневых гранул (фиг. 1 и 2). Отмечена вариабельность количества выявляемых гранул, интенсивности их окраски, размеров. Прослеживалась определенная взаимосвязь с характером морфологических изменений.

На фиг. 1 - дифтерийный токсин в большом числе кардиомиоцитов (стрелки) кролика при экспериментальном дифтерийном миокардите. Заметны очаги диффузного распределения токсина в паренхиме. Непрямой иммунопероксидазный метод. Слабая докраска гематоксилином. Ув.x100.

На фиг. 2 - высокая концентрация дифтерийного токсина в альвеолоцитах (стрелки) кролика при экспериментaльном дифтерийном миокардите. Непрямой иммунопероксидазный метод. Слабая докраска гематоксилином. Ув.x220.

Проведено исследование миокарда троих детей, умерших от гипертоксической формы дифтерии, где прижизненно и посмертно была выделена дифтерийная палочка. Выявление дифтерийного токсина с помощью модифицированного непрямого иммунопероксидазного метода показало его наличие в клетках органа в виде коричневатых гранул.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить раннюю прижизненную диагностику дифтерии, где в качестве объектов исследования могут служить мазки из зева, смывы и пленки из трахеи и бронхов.

Большую значимость имеет исследование постмортального материала при атипичном течении дифтерии как в остром, так и в отдаленном периоде, при котором выявление дифтерийного токсина в ткани может иметь решающее значение для подтверждения диагноза.

Обнаружение токсина с помощью предлагаемого способа и одновременная оценка характера патоморфологических изменений в органах расширяет возможности представленного метода как диагностического и позволяет проводить углубленное изучение патогенеза такой тяжелой инфекции, как дифтерия.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении и в научно-исследовательской деятельности.

Способ может быть использован в области медицинской диагностики, а именно в прижизненной и постмортальной диагностике дифтерийной инфекции. На криостатные срезы органов обследуемого, предварительно зафиксированные в ацетоне, наносят моноклональные антитела к токсину. Затем обрабатывают в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина с нанесением антивидового конъюгата, и при наличии положительной окраски в клетках в виде темно-коричневых гранул свидетельствуют о наличии дифтерийного токсина. Способ более прост в исполнении и позволяет проводить раннюю прижизненную диагностику дифтерии. 2 ил.

Способ выявления дифтерийного токсина в тканях, отличающийся тем, что криостатные срезы органов фиксируют в ацетоне, наносят моноклональные антитела к токсину, обрабатывают в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина, в последующем наносят антивидовой конъюгат и наличие положительной окраски в клетках в виде темнокоричневых гранул свидетельствует о выявлении дифтерийного токсина.