СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Описание патента на изобретение RU2225614C2

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике респираторного папилломатоза, и может быть использовано для выявления и лечения данной патологии.

Респираторный папилломатоз - тяжелейшее заболевание в оториноларингологии, интерес к которому не только не снижается, но и постоянно растет. Значимость проблемы респираторного папилломатоза связана с тем, что, поражая гортань, папилломатозный рост приводит к сужению ее просвета, нарушению жизненно важных функций органа - дыхательной и голосообразования. Развивающаяся в связи с этим хроническая респираторная гипоксемия - стенотическая болезнь - имеет место в несформировавшемся растущем организме, являясь причиной нарушений физического, психомоторного и эмоционального развития ребенка, дисфункций различных органов и систем. Папилломы являются самой частой доброкачественной опухолью гортани у взрослых и почти единственной опухолью этого органа у детей. Будучи по гистоморфологическому строению доброкачественным образованием, у детей они чаще всего отличаются упорным рецидивированием, бурным ростом, приводящим к резкому сужению дыхательной трубки, вплоть до полного ее закрытия, угрожая тем самым жизни ребенка. В настоящее время в этиопатогенезе респираторного папилломатоза вирусная природа заболевания не вызывает сомнения и связывается с вирусом папилломы человека - ВПЧ (ДНК-содержащему из рода паповавирусов). Выявление экспрессии антигена вируса папилломы человека (ВПЧ) для идентификации ВПЧ в свежевыделенном клиническом материале, позволяет проследить связь между ВПЧ инфекцией и развитием папилломатоза гортани.

В связи с этим не вызывает сомнения необходимость выявления антигена вируса папилломы человека в слизистой оболочке гортани для подтверждения этиологии заболевания в каждом конкретном случае и осуществления контроля за эффективностью проводимого лечения.

Известным методом выявления ВПЧ является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанный [Маниатисом Т., Фрич Э., Сэмбруком Дж. Методы клеточной инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир - 1984]. Суть полимеразной цепной реакции заключается в возможности многократного копирования определенного участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы, что дает возможность визуализировать продукты реакции в электрофорезе. Использование термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Termus thermofilus, позволяет автоматизировать процедуру. Для выполнения ПЦР под наркозом при прямой ларингоскопии производят забор материала (во время оперативного вмешательства). Затем из этого материала выделяют определенный фрагмент ДНК и синтезируют фрагменты длиной 500 пар оснований при помощи праймеров определенного состава, которые отвечают за начало репликации вируса. Реакция состоит из 30 трехступенчатых циклов, протекающих при следующих условиях: 1-я ступень - 60'' при 94oС, 2-я ступень - 60'' при 58oС, 3-я ступень - 90'' при 72oС. Реакцию проводят на амплификаторе в микроцентрифужных пробирках типа "Эппендорф" объемом 500 мкл, содержащих рабочий буфер. Продукты реакции визуализируют в электрофорезе в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Однако данный метод является достаточно дорогостоящим и трудоемким, так как связан с необходимостью использования специальных реагентов и проведения множества циклов. Поскольку для данного метода необходимо наличие специальной дорогостоящей аппаратуры, то данный метод может быть использован только в крупных медицинских центрах. Способ не обладает достаточной точностью.

Наиболее близким к предлагаемому нами методу является способ определения антигена вируса папилломы человека иммунопероксидазным методом, описанным [Ernest E. Lack et al. - Intervirology 14: 148-154 (1980)]. Берут парафиновые срезы с биоптатов папиллом, производят депарафинизацию срезов, обрабатывают 0,5% раствором Н2О2 в течение 30 минут, затем промывают в буфере, обрабатывают 20% нормальной сывороткой в течение 30 минут, наносят кроличьи антитела к вирусу ВПЧ на 45-60 минут, промывают в буфере, далее наносят коньюгированную сыворотку на 60 минут, обрабатывают диаминобензидином в течение 5-8 минут и окрашивают гематоксилином, препараты смотрят при помощи световой микроскопии.

В данном способе имеются следующие недостатки: биоптаты возможно взять только в процессе оперативного вмешательства, обработка папиллом производится в достаточно агрессивной среде (депарафинизация в ксилоле), проведение всех этапов способа достаточно длительно во времени. Взятие биоптата, его фиксация, заливка в парафин, приготовление гистологических срезов занимает 6-10 часов и 3-4 часа уходит на проведение иммунопероксидазной реакции. Недостаточная точность, вследствие использования поликлональных антител не позволяет определять отдельные серотипы вируса, что имеет значение для прогноза течения заболевания. Также имеются особенности работы с парафиновыми срезами - высокая вероятность фонового окрашивания, что затушевывает истинные результаты.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности. Этот результат достигается тем, что при осуществлении непрямой иммунопероксидазной реакции согласно изобретению берут мазки со слизистой гортани "эпителиальной щеточкой", фиксируют в ацетоне в течение 10-15 минут, обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы, выявление проводят в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Забор материала "эпителиальной щеточкой" со слизистой гортани при непрямой ларингоскопии является неинвазивным и позволяет многократно в течение лечения контролировать наличие ВПЧ в очаге поражения.

Фиксация в ацетоне позволяет сохранить структуры и устранить фоновое окрашивание при пероксидазой реакции. Обработка в 1% БСА, содержащим 0,5% Тритон Х - 100 позволяет адсорбировать загрязняющие антитела и антигены, находящиеся в тканях, а также способствует повышению проницаемости клеточных мембран, что обеспечивает лучшие условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном ВПЧ, что еще больше повышает точность.

Использование моноклональных антител позволяет выявлять как общий антиген ВПЧ, так и отдельные серотипы (6, 11, 18), что обеспечивает высокую точность диагностики.

Сущность способа заключается в следующем: мазок берут с помощью специально приспособленной "эпителиальной щеточки" со слизистой оболочки гортани, затем фиксация в ацетоне 10-15 минут, обработка в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработка 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, нанесение моноклональных антител к ВПЧ в течение 45 минут при 37oС, трехкратная промывка в буфере, по три минуты в каждом, затем нанесение вторых антител, связанных с пероксидазой, в течение 40 минут, промывка в буфере, обработка раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% Н2О2 в течение 1-2 минут, двукратная промывка в дистилированной воде, докраска метиленовой синькой, микроскопия.

Выявление проводят в световом микроскопе по наличию темно- и светло-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1. Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными).

2. Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было произведено исследование мазков 20 детей с рецидивирующим папилломатозом гортани. В случаях резко положительной экспрессии антигена вируса папилломы человека клинически наблюдалось частое рецидивирование и распространенность процесса (14 случаев), а при отрицательном ответе (6 человек) - увеличение межрецидивного промежутка и переход в устойчивую ремиссию (Таблица).

Пример 1.

Больная Р. О., 15 лет, истории болезни 16273 от 23.11.1999 года с диагнозом распространенный рецидивирующий папилломатоз глотки, гортани, трахеи. Из анамнеза: больна с двухлетнего возраста, рецидивы заболевания в среднем 1 раз в 4 - 6 месяцев, в последнее время 1 раз в год. Трахеостома наложена в 6 лет. При поступлении состояние средней тяжести, дыхание через естественные дыхательные пути резко затруднено. При непрямой ларингоскопии папилломы единичные в области передней комиссуры, в трахее - на уровне края трахеотомической трубки. При непрямой ларингоскопии щеточкой взят мазок из гортани. Материал нанесен на предметное стекло, высушен и зафиксирован в ацетоне в течение 10-15 минут. Затем обработан в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработан 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, после этого были нанесены моноклональные антитела на 45 минут при 37oС, троекратно промыт в буфере по три минуты в каждом, затем были нанесены вторые антитела, связанные с пероксидазой на 40 минут, промыты в буфере, обработаны раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% H2O2 в течение 1-2 минут, затем двукратно промыт в дистилированной воде, докрашен метиленовой синькой и после этого выполнена микроскопия в световом микроскопе. При этом в мазках со слизистой гортани с помощью предлагаемого способа была выявлена четкая экспрессия антигена ВПЧ (фото 1). В настоящее время наблюдаются рецидивы в среднем один раз в год.

В результате проведенных нами исследований можно сделать следующие выводы:
1. Предложенный способ обладает высокой точностью, так как в отличие от прототипа позволяет определять отдельные серотипы вируса, отсутствует фоновое окрашивание и исключается возможность ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

2. Обеспечивается быстрое выявление антигена (2,5-3 часа), в то время как в прототипе требуется 9-14 часов.

Таким образом, исследование 20 случаев (см. таблицу) в течение полутора лет показало хорошую воспроизводимость предлагаемого способа, что свидетельствует о его достаточной надежности. Высокая чувствительность и специфичность данного способа подтверждалась результатами ПЦР исследований и данными клинических наблюдений.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения экспрессии антигена ВПЧ и соответственно оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения противорецидивной терапии.

Похожие патенты RU2225614C2

название год авторы номер документа
МЕТОД ОБНАРУЖЕНИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА ШЕЙКИ МАТКИ 2015
  • Маккаллини Винченцо
  • Ди Бенедетто Джузеппе
RU2702334C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ДИСПЛАЗИЙ И РАКА ШЕЙКИ МАТКИ И ПАПИЛЛОМАТОЗА ГОРТАНИ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭТИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ЕЕ ОСНОВЕ 2001
  • Киселев В.И.
  • Киселев О.И.
  • Киселев М.В.
RU2196568C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ПАПИЛЛОМАТОЗА 2004
  • Ашуров Закир Мадад Оглы
  • Кадырова Эльвира Вахитовна
  • Манзенюк Оксана Юрьевна
  • Слоева Анна Ивановна
  • Исаев Васиф Муса Оглы
  • Алышов Фариз Алескер Оглы
RU2280871C2
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ СМЕШАННОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ 2010
  • Кветная Ася Степановна
  • Седенко Олеся Владимировна
  • Власюк Василий Васильевич
  • Бабаченко Ирина Владимировна
RU2456616C2
ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ 2005
  • Сасагава Тосиюки
  • Тохда Хидеки
  • Хама Юко
RU2405568C2
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ПРЕПАРАТ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ РЕЦИДИВИРУЮЩЕГО ПАПИЛЛОМАТОЗА ГОРТАНИ 2005
  • Свешников Петр Георгиевич
  • Киселёв Всеволод Иванович
  • Яроцкий Сергей Викторович
  • Могутов Михаил Александрович
RU2290204C1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ 2019
  • Клотченко Сергей Анатольевич
  • Васин Андрей Владимирович
  • Плотникова Марина Александровна
  • Тараскин Александр Сергеевич
  • Ложков Алексей Александрович
  • Гюлиханданова Наталия Евгеньевна
  • Елпаева Екатерина Сергеевна
  • Грядунов Дмитрий Александрович
  • Филиппова Марина Александровна
  • Савватеева Елена Николаевна
RU2733379C1
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ 2000
  • Насыров Р.А.
  • Маньков М.В.
RU2180120C1
МУКОЗАЛЬНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ (ВАРИАНТЫ) 2008
  • Киселев Всеволод Иванович
  • Свешников Петр Георгиевич
  • Пальцев Михаил Александрович
RU2377305C1
СТАБИЛЬНЫЙ ВЕКТОР КОНСТИТУТИВНО ВЫСОКОЙ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВПЧ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ ЭТИМ ВЕКТОРОМ РЕКОМБИНАНТНЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ 2010
  • Сюнг Моон-Хи
  • Поо Харуонг
  • Ли Иль Хан
RU2492240C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 225 614 C2

Реферат патента 2004 года СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена вируса папилломы человека. Проводят взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н2О2, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, при этом берут мазки со слизистой гортани "эпителиальной щеточкой", фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки. 1 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 225 614 C2

Способ выявления антигена вируса папилломы человека, включающий взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н2О2, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, отличающийся тем, что берут мазки со слизистой гортани “эпителиальной щеточкой”, фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2004 года RU2225614C2

ERNEST E
LACK et al
Intervirology
Способ получения фтористых солей 1914
  • Коробочкин З.Х.
SU1980A1
Раздвижной паровозный золотник с подвижными по его скалке поршнями между упорными шайбами 1922
  • Трофимов И.О.
SU148A1
СПОСОБ ЭКСПРЕСС - ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕТИЧЕСКИХ НЕЙРОИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ 1993
  • Аксенов О.А.
  • Безух С.М.
  • Сорокина М.Н.
  • Мурина Е.А.
RU2129717C1
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ВРОЖДЕННЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ 1995
  • Аксенов О.А.
  • Осипова З.А.
  • Иванова В.В.
  • Камальдинова Э.Г.
RU2089910C1
US 5437951 A1, 01.08.1995.

RU 2 225 614 C2

Авторы

Насыров Р.А.

Цветков Э.А.

Чмырева Н.Н.

Науменко Н.Н.

Даты

2004-03-10Публикация

2002-01-11Подача