СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ТОКСИЧЕСКИХ ФОРМ ДИФТЕРИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 1998 года по МПК A61B10/00 A61K39/05 G01N33/536 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в клинической практике.

Частота регистрации токсических и распространенных форм дифтерии у детей нередко с неблагоприятным исходом предопределяет использование современных методологических подходов для своевременной квалифицированной этиологической диагностики этих форм. Применяемая в настоящее время схема бактериологической диагностики дифтерийной инфекции, регламентированная приказом Минздрава СССР N450 от 02.01.1986 г., громоздка, ее проведение занимает несколько дней и не содержит доступных и нетрудоемких методов обнаружения токсина в биологических жидкостях.

Известен способ определения токсигенности штаммов дифтерийной палочки, рекомендуемый в приказе N450 Минздрава СССР от 2.04.1986 г., в основе которого лежит взаимодействие между токсином и антитоксином, которое происходит в плотных питательных средах в местах оптимальных количественных соотношений токсина, продуцируемого коринобактериями, диффундирующего в агар, и антитоксина, содержащегося в антитоксической противодифтерийной сыворотке. На этих участках выпадает преципитат в виде белых линий, "стрел" или "усов" (реакция преципитации). Однако учет токсигенных свойств культуры возможен только на 3-4-й день после взятия материала на анализ: 1-й день - посев исследуемого материала, 2-й день - постановка пробы на токсигенность, 3-й день - учет пробы на токсигенность, 4-й день - учет токсигенных свойств культуры, выделенной в третий день исследования через 48 ч роста первичного посева и выдача документированного ответа о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Таким образом способ требует много времени и трудозатрат и не позволяет провести постановку диагноза на раннем этапе заболевания.

Для экспресс-диагностики дифтерийного токсина в среде культивирования штаммов, выделенных при бактериологическом обследовании с диагностической и профилактической целью, предлагается способ определения токсина в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с помощью коммерческого эритроцитарного дифтерийного антительного диагностикума, действующим началом которого являются связанные с фиксированными формалином и обработанными танином эритроцитами барана противодифтерийные антитела, вступающие во взаимодействие с дифтерийным токсином (Инструкция по применению эритроцитарного дифтерийного антительного диагностикума для определения токсина в РНГА. Утверждена Минздравом СССР от 17.12.1991 г.). Материалом для исследования служит надосадочная жидкость среды культивирования штаммов. Накануне исследования РНГА материал должен быть засеян в жидкую питательную среду. Пробирки с исследуемыми образцами выдерживают при 37±1^oC в течение 18±2 часов. РНГА проводится в микропланшетах микротитратора. Учет результатов реакции производят через 1,5-2 ч после ее постановки по характеру осадка в лунках планшета. Этот способ позволяет получить результат анализа только через сутки после взятия материала на анализ, достаточно трудоемок и предполагает одновременное исследование проб от нескольких больных на одном планшете, что вынуждает накапливать пробы и замедляет анализ. Кроме того, рабочее разведение эритроцитного диагностикума, анатоксина, служащего положительным контролем, а также фосфатно-солевого буфера, содержащего нормальную кроличью сыворотку, может храниться лишь 8-10 ч, что требует дополнительных затрат времени и диагностикума для ежедневного приготовления свежих растворов.

Для устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают способ иммунологической экспресс-диагностики токсических форм дифтерийной инфекции с целью ускорения и упрощения индикации дифтерийного токсина, продуцируемого коринобактериями и поступившего в кровь больного, а также с целью ранней диагностики токсических и субтоксических форм дифтерийной инфекции и своевременного начала специфической терапии.

Поставленные авторами цели достигаются тем, что при использовании известного способа учета реакции агглютинации суспензии частиц-носителей, сенсибилизированных дифтерийном антитоксином, с материалом, исследуемым на присутствие дифтерийного токсина, согласно изобретению, в качестве исследуемого материала используют сыворотку крови, а в качестве дисперсии частиц-носителей - монодисперсный латекс с размером частиц 0,7-1,9 мкм, постановку реакции агглютинации осуществляют в капле на предметном стекле, учет результатов производят через 3^oC10 мин после смешения реагентов и по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинантов судят о присутствии дифтерийного токсина в сыворотке крови. Положительный результат реакции является основанием для постановки предварительного диагноза: токсическая форма дифтерийной инфекции, который может быть поставлен уже через 1 ч после взятия материала на анализ.

Авторами впервые предложен способ экспресс-диагностики токсигенных форм дифтерийной инфекции, который позволяет поставить предварительный диагноз уже через 1 ч после взятия крови больного на анализ, основываясь на результатах агглютинации монодисперсного латекса, сенсибилизированного дифтерийным антитоксином, с сывороткой крови больного, причем постановка реакции не требует специального оборудования, она может быть использована в практике любой клинической лаборатории, а постановка реакции на предметном стекле позволяет производить анализ отдельного образца сыворотки крови больного сразу после взятия материала на анализ.

Авторами предложено применять в качестве дисперсии частиц-носителей монодисперсный латекс с размерами частиц в интервале 0,7-1,9 мкм, поскольку более мелкие частицы не могут образовывать достаточно крупные, видимые глазом агглютинанты, а более крупные частицы создают собственный мелкозернистый фон, на котором наблюдение за образованием агглютинантов также затруднено. Интервал времени, в течение которого может быть достоверно учтена положительная РАЛ, составляет 3-10 мин, поскольку при меньшем времени не успевают образоваться достаточно крупные видимые глазом агглютинанты, а при большем интервале времени могут происходить неспецифические взаимодействия, а также подсыхание капли.

Предлагаемый способ иммунологической экспресс-диагностики токсических форм дифтерийной инфекции осуществляют следующим образом. Сыворотку крови больного прогревают при 56±1^oC в течение 30 мин. Сыворотки со следами гемолизованной крови исследованию не подлежат. Индикация дифтерийного токсина производится в реакции агглютинации латекса (РАЛ). Постановка РАЛ осуществляется в капле на стекле. При постановке реакции каплю исследуемой сыворотки смешивают стеклянной палочкой с каплей фосфатно-солевого буфера и добавляют латексный диагностикум, который представляет собой монодисперсный латекс с размером частиц 0,7-1,9 мкм, сенсибилизированный дифтерийным антитоксином. Объем капель для анализа 20-50 мкл. Учет результатов реакции проводится на темном фоне при косом освещении визуально или с помощью лупы через 3-10 мин после смещения по 4-крестной системе. Реакция считается отрицательной, если капля сохраняет однородный молочно-белый цвет. Реакция считается положительной, если в капле образуются хлопья агглютинатов при осветлении фона капли (4+), без осветления фона (+3), либо отчетливый мелкозернистый осадок по всему объему капли (2+). Слабая зернистость в объеме (1+) расценивается как сомнительная реакция. Одновременно с постановкой реакции с исследуемой сывороткой ставятся контрольные реакции.

1. Отрицательный контроль:
- латексного диагностикума с сывороткой, не содержащей дифтерийный токсин;
- латексного диагностикума с раствором, которым разводились сыворотки:
2. Положительный контроль:
- латексного диагностикума с сывороткой больного, содержащей дифтерийный токсин.

При определении титра выполняют последовательное двухкратное разведение исследуемой сыворотки растворителем.

Положительный результат реакции является основанием для постановки предварительного диагноза: токсическая форма дифтерийной инфекции, который может быть поставлен уже через 1 ч после взятия материала на анализ. При невыявлении дифтерийного токсина в РАЛ предварительный и окончательный ответы выдают по общепринятой методике (приказ N450).

Результаты применения предлагаемого метода в клинической практике представлены в табл.1.

Положительные результаты (на 4+) были получены только с пробами больных дифтерийной инфекцией. Сомнительная реакция (на 1+) зарегистрирована у 2 больных инфекционным мононуклеозом и одного острым лейкозом. Всего обследован 41 ребенок, дифтерийный токсин обнаружен у 24 больных с установленным клиническим диагнозом дифтерия, причем для всех из 21 больного ребенка с тяжелыми формами дифтерийной инфекции получена положительная РАЛ. Выделение токсигенных штаммов дифтерийной палочки подтвердило диагноз бактериологически лишь у 14 из этих детей (67%). Таким образом, применение предлагаемого способа экспресс-диагностики токсигенных форм дифтерийной инфекции в сыворотке крови позволило дополнительно диагностировать дифтерию в тяжелой форме у 7 детей (33%). При локализованной форме дифтерии предлагаемый способ менее эффективен: из 12 обследованных больных только у 3 обнаружен токсин и еще у 3 получена сомнительная реакция. В остальных случаях низкое содержание токсина, поступающего в кровь при локализованной форме, выходит за пределы чувствительности предлагаемого способа.

Предлагаемый способ позволяет обнаружить токсин дифтерийной палочки в крови больных тяжелыми формами дифтерийных инфекций в самом начале обследования больных (через 1 ч после взятия материала на анализ). Кроме того, в случае отрицательного бактериологического обследования с выраженными клиническими формами дифтерийной инфекции результаты РАЛ с достаточной вероятностью служат подтверждением диагноза. Использование предлагаемого способа в лабораторной практике для ранней диагностики токсигенных форм дифтерийной инфекции весьма эффективно при определении тактики целенаправленной терапии, что не исключает необходимость проведения бактериологического исследования по схеме, регламентированной приказом N450 (табл.2)
Приведенные данные табл.2 свидетельствуют об эффективности предлагаемого нами метода (РЛА), обеспечивающего установление диагноза через 1 ч после забора материала. Между тем использование методов, предусматриваемых рамками приказа 450 МЗ СССР, установление диагноза культуральным методом возможны на 4-5-е сутки, а с помощью РНГА (из-за исследования поздних сывороток) на 30-й и более дни болезни.

Способ предназначен для иммунологической экспресс-диагностики токсических форм дифтерийной инфекции. Диагностику осуществляют путем учета результатов реакции агглютинации суспензии частиц-носителей, сенсибилизированных дифтерийным антитоксином, с материалом, исследуемым на присутствие дифтерийного токсина. В качестве исследуемого материала используют сыворотку крови. В качестве дисперсии частиц-носителей - монодисперсный латекс с размером частиц 0,7 - 1,9 мкм. Постановку реакции агглютинации осуществляют в капле на предметном стекле. Учет результатов производят через 3 - 10 мин после смешения реагентов и через 1 ч после взятия материала на анализ по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов. При положительных результатах реакции ставят диагноз: токсическая форма дифтерийной инфекции. Способ эффективен, информативен, обеспечивает постановку диагноза через 1 ч после забора пробы крови на анализ. 2 табл.

Способ иммунологической экспресс-диагностики токсических форм дифтерийной инфекции путем учета результатов реакции агглютинации суспензии частиц-носителей, сенсибилизированных дифтерийным антитоксином, с материалом, исследуемым на присутствие дифтерийного токсина, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют сыворотку крови, а в качестве дисперсии частиц-носителей - монодисперсный латекс с размером частиц 0,7 - 1,9 мкм, постановку реакции агглютинации осуществляют в капле на предметном стекле, учет результатов производят через 3 - 10 мин после смещения реагентов и через 1 ч после взятия материала на анализ по наличию или отсутствию наблюдаемых визуально агглютинатов и при положительных результатах реакции ставят диагноз-токсическая форма дифтерийной инфекции.