СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФИТОСПОРИН Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов на основе бактерий рода Bacillus, применяющихся в сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине, а также для иных целей, везде, где используются бактерии рода Bacillus.

В настоящее время создан биопрепарат Фитоспорин на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26 ВНИИСХМ 128 для защиты растений от комплекса болезней (патент N 2099947).

Препарат содержит живые клетки и споры B. subtilis и наполнитель. Препарат разлит в стерильные ампулы, лиофильно высушен и запаян. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат, сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при лиофильном высушивании препарата.

Однако недостатком предложенного способа получения биопрепарата Фитоспорин является необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для лиофильной сушки, а сам период сушки довольно длителен (50-80 ч).

Известен способ получения препарата из бактерий рода Bacillus (RU N 2076902 C 12 N/20) методом жидкостного глубинного культивирования, включающий засев питательной среды маточной культурой одной из предыдущих генераций (т.е. споровой культурой) в количестве 1-2% от объема засеваемой среды (т. е. 1,6-3•10⁷ кл/мл), культивирование проводят 14 суток при температуре 35-37^oC и отделяют целевой продукт в виде спор. Наполнитель или стабилизатор не используется, а используется естественное свойство бактерий переходить в споры, которые хорошо сохраняются, для непосредственного использования получающейся взвеси спор в "отработанной среде" в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки, что позволяет снизить производственные затраты за счет экономии на лиофильной сушке.

Однако недостатками способа, принятого за прототип, являются:
1. Длительность процесса культивирования: культивирование проводят 14 суток.

2. Низкий выход биомассы: в 1 мл получают 1,6-3 млрд живых клеток в форме спор.

3. Недостаточно длительный срок хранения: в течение 4 месяцев хранения при температуре 6^oC и при комнатной температуре (18-25^oC) не снижается количество живых спор.

Задача изобретения - разработать способ получения бактерийного препарата из бактерий рода Bacillus, более производительный, менее длительный и с большим сроком хранения качественной биомассы в жидком виде без использования лиофильной сушки.

Поставленная задача решается получением биомассы штамма Bacillus subtilis 26 путем гомогенного глубинного культивирования в жидкой питательной среде следующего состава, %: пептон ферментативный 0,2-1,0; магний сернокислый 0,01-0,05; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01-0,05; натрия цитрат 0,1-0,5; медь сернокислая 0,0001-0,001; цинк сернокислый 0,0001- 0,001; железо сернокислое 0,00001-0,0001; кальций хлористый 0,01-0,05; марганец сернокислый 0,001-0,01; глюкоза 0,2-1,0; вода - остальное. Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве 1-2•10⁹ кл/мл. Культивирование осуществляют в течение 12-16 ч.

Полученная культуральная жидкость содержит 24-26 млрд кл/мл (70-100% спор). К полученной биомассе добавляется стабилизатор биомассы (гуми 0,5-2% или сульфит натрия 2-6%), что обеспечивает сохранение количества живых колониеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 месяцев. Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу штамма B. subtilis 26 и стабилизатор биомассы, используется в качестве бактерийного препарата Фитоспорин в жидкой форме.

Использование гуми как стабилизатора биомассы препарата Фитоспорин улучшает его свойства в качестве сельскохозяйственного препарата за счет обогащения гуминовыми кислотами, полезными для почвообразования.

Если биомасса бактерий рода Bacillus используется для получения биопрепаратов, применяемых в ветеринарии или медицине, в качестве стабилизатора биомассы используют сульфит натрия в дозе 2-6%.

Таким образом, получение препарата Фитоспорин в жидкой форме дает возможность избежать дорогостоящего этапа по высушиванию бактериальной массы, сократить время культивирования, увеличить выход биомассы, хранить препарат до 8 месяцев.

Пример 1. Посевным материалом для подращивания служила культура штамма Bacillus subtilis 26 Д, выращенная на агаризованной полусинтетической питательной среде того же состава, что и среда для культивирования, в течение 18-24 ч.

В качестве посевного материала для основного процесса культивирования использовали популяцию штамма в экспоненциальной фазе роста, выращенную в жидкой полусинтетической питательной среде. Посевной материал вносили однократно в количестве 20% от объема используемой для культивирования питательной среды - 70 л. Посевная доза составляла 0,1-0,5•10⁹ кл/мл.

Глубинное культивирование осуществляют при 37^oC при насыщении среды кислородом в пределах 60-70% и перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин. Контроль за ростом культуры проводят путем отбора проб через каждые 2 ч и определении концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности и на ФЕК 56М, количество живых колониеобразующих клеток (КОЕ) определяют высевом на плотные питательные среды, наличие спор определяют в мазках культуры, окрашенных по Грамму.

Через 16-18 ч культивирования, когда биомасса достигает максимальных значений (24-26•10⁹ кл/мл) и наблюдается переход в споры 80-100% популяции, культивирование прекращают, культуральную жидкость с бактериальными клетками сливают и добавляют стабилизатор биомассы (гуми 0,5-2% или сульфит натрия 2-6%).

Предлагаемый способ периодического культивирования позволяет получить 70 л жидкого препарата Фитоспорин с содержанием бактериальных клеток 24-26•10⁹ кл/мл.

Пример 2 (оптимальный). Маточную культуру для засева реактора берут в экспоненциальной фазе в количестве 1-2•10⁹ кл/мл. Культивирование проводят как в примере 1. Продолжительность культивирования составляет 12-14 ч. Максимальное содержание биомассы составляет 24-26 млрд. кл/мл и содержит 70-100% спор.

Пример 3. Маточную культуру для засева реактора берут в экспоненциальной фазе в количестве 4-6•10⁹ кл/мл. Культивирование проводят как в примере 1. Продолжительность культивирования составляет 10-11 ч. Максимальное содержание биомассы составляет 20-22 млрд кл/мл и содержит 70-100% спор.

Пример 4. Маточную культуру для засева реактора берут в стационарной фазе роста в виде спор в количестве 1-2•10⁹ кл/мл. Культивирование проводят как в примере 1. Продолжительность культивирования составляет 18-20 ч. Максимальное содержание биомассы составляет 24-26 млрд кл/мл и содержит 70-100% спор.

Таким образом, оптимальным является использование маточной культуры в экспоненциальной фазе роста в количестве 1-2•10⁹ кл/мл.

Сводные данные по производительности предлагаемого способа культивирования в сравнении с прототипом представлены в таблице.

Источники информации
1. RU, патент 2099947, C 21 N /20, 25.12.97.

2. RU, патент, 2076902, C 12 N/20, 10.04.97.

Изобретение относится к биотехнологии. Бактерии рода Bacillus культивируют при непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде, содержащей пептон ферментативный и минеральные соли. Засев среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста в количестве (1-2)•10⁹ кл/мл. Культивирование осуществляют в течение 12-14 ч до достижения максимальных значений биомассы (24-26)•10⁹ кл/мл и перехода в споры 70-100% популяции. Культуральную жидкость сливают и добавляют стабилизатор биомассы (гуми - 0,5-2% или сульфит натрия - 2-6%). Получают препарат Фитоспорин в жидком виде. Препарат хранится без лиофильной сушки в течение 6-8 месяцев. 1 табл.

1. Способ получения препарата Фитоспорин из бактерий рода Bacillus, включающий засев питательной среды маточной культурой, жидкостное культивирование в среде, содержащей минеральные соли и пептон, при постоянной аэрации и отделение целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споровой биомассой, отличающийся тем, что маточную культуру засевают в количестве (1-2)•10⁹ кл/мл в экспоненциальной фазе роста, культивирование проводят при постоянном перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в течение 12-14 ч, а после отделения целевого продукта его смешивают со стабилизатором гуми или сульфитом натрия в количествах соответственно 0,5-2,0% и 2-6%.