СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФИТОСПОРИН Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов на основе бактерий рода Bacillus, применяющихся в сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине, а также для иных целей, везде, где используются бактерии рода Bacillus.

Используется для крупнотоннажного производства препарата Фитоспорина.

В настоящее время создан биопрепарат Фитоспорин на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 25 ВНИСХМ 128 для защиты растений от комплекса болезней [1].

Препарат содержит живые клетки и споры B. subtilis и наполнитель. Препарат разлит в стерильные ампулы, лиофильно высушен и запаян. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат, сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при лиофильном высушивании препарата.

Однако недостатком предложенного способа получения биопрепарата Фитоспорина является необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для лиофильных сушки, а сам период сушки довольно длителен (50-80 ч).

Известен способ получения препарата из бактерий рода Bacillus [2] методом жидкостного глубинного культивирования, включающий засев питательной среды маточной культурой одной из предыдущих генераций (т.е. споровой культурой) в количестве 1-2% от объема засеваемой среды (т.е. 1,6-3•10⁷ кл/мл), культивирование проводят 14 сут при температуре 35-37^oC и отделяют целевой продукт в виде спор. Наполнитель или стабилизатор не используется, а используется естественное свойство бактерий переходить в споры, которые хорошо сохраняются, для непосредственного использования получающейся взвеси спор в "отработанной среде" в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки, что позволяет снизить производственные затраты за счет экономии на лиофильной сушке.

Однако недостатком способа, принятым за прототип, является.

1. Длительность процесса культивирования: культивирование проводят 14 сут.

2. Низкий выход биомассы: в 1 мл получают 1,6 - 3 млрд. живых клеток в форме спор.

3. Недостаточно длительный срок хранения: в течение 4 мес хранения при температурах 6^oC и при комнатной температуре 18-25^oC не снижается количество живых спор.

4. Недостаточный объем получаемого препарата: получают за 1 цикл культивирования 100 л.

Задача изобретения - разработать высокопроизводительный способ получения бактерийного препарата из бактерий рода Bacillus в реакторах больших объемов (на 10000 л), менее длительный и с большим сроком хранения качественной биомассы в жидком виде, без использования лиофильной сушки.

Поставленная задача решается получением биомассы штамма Bacillus subtilis 26 в реакторах больших объемов (на 10 000 л) методом продленного периодического гомогенного глубинного культивирования в жидкой питательной среде следующего состава, %: пептон ферментативный 0,2-1,0, магний сернокислый 0,01-0,05, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01-0,05; натрия цитрат 0,1-0,5; медь сернокислая 0,0001-0,001; цинк сернокислый 0,0001-0,001; железо сернокислое 0,00001-0,0001; кальций хлористый 0,01-0,05; марганец сернокислый 0,001-0,01; глюкоза 0,2-1,0; вода-остальное.

Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве 1-3•10⁹ кл/мл. Подращивание посевного материала осуществляют последовательно в реакторах возрастающих объемов. Объем каждого последующего реактора больше предыдущего в 10 раз. Культуру пересевают в экспоненциальной фазе, что обеспечивает самую высокую скорость роста биомассы. В последнем реакторе на 10 000 л выращивают культуру в течение 14-16 ч до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры.

Полученная культуральная жидкость содержит 22-24 млрд. кл/мл (70-100% спор). К полученной биомассе добавляется стабилизатор биомассы (гуми 0,5-2% или сульфид натрия 2-6%), что обеспечивает сохранение количества живых колонеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 мес.

Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу штамма B. subtilis 26 и стабилизатор биомассы, используется в качестве бактерийного препарата Фитоспорин в жидкой форме.

Предлагаемый способ продленного периодического культивирования позволяет получить за 24-29 ч культивирования 7000-8000 л жидкого препарата Фитоспорин с содержанием бактериальных клеток 24-26 млрд. кл/мл.

Использование гуми, как стабилизатора биомассы препарата Фитоспорин, улучшает его свойства в качестве сельскохозяйственного препарата за счет обогащения гуминовыми кислотами, полезными для почвообразования [3].

Если биомасса бактерий рода Bacillus используется для получения биопрепаратов, применяемых в ветеринарии или медицине, в качестве стабилизатора биомассы используют сульфит натрия в дозе 2-6%.

Пример 1 (оптимальный)
Подращивание посевного материала осуществляют последовательно в реакторах возрастающих объемов. Объем каждого последующего реактора больше предыдущего в 10 раз. Культуру пересевают в экспоненциальной фазе, что обеспечивает самую высокую скорость роста биомассы.

Подращивание и последующее культивирование штамма Bacillus subtilis 26Д вели на полусинтетической питательной среде, содержащей минеральные соли и пептон, при 37^oC при насыщении среды кислородом в пределах 60-70% и перемешивании со скоростью вращения мешалки 250-300 об/мин.

Контроль за ростом культуры проводили путем отбора проб через каждые 2 ч и определении концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности и на ФЕК 56М, количество живых колонеобразующих клеток (КОЕ) определяли высевом на плотные питательные среды, наличие опор определяли в мазках культуры, окрашенных по Грамму.

Посевным материалом для подращивания служила культура штамма Bacillus subtilis 26Д, выращенная на агаризованной полусинтетической питательной среде того же состава, что и среда для культивирования в течение 18-24 ч.

Подращивание начинают с засева маточной агаровой культурой ферментера за 10 л и осуществляют подращивание в течение 4-5 ч до достижения культурой стадии экспоненциального роста и концентрации клеток 12-14 млрд. кл/мл, затем культуру переносят в реактор на 100 л, разбавляя ее свежей питательной средой в 10 раз, чтобы посевная доза составляла 1,2-1,4 млрд. кл/мл и выращивают в течение 3-4 ч до концентрации клеток 12-14 млрд./мл и далее переносят в реактор на 1000 л и вновь производят разбавление свежей питательной средой до концентрации 1,2-1,4 млрд. кл/мл и выращивают в течение 3-4 ч до концентрации клеток 12-14 млрд. кл/мл и переносят в реактор на 10 000 л, разбавляют свежей питательной средой до начальной концентрации клеток 1,2-1,4 млрд. кл/мл и выращивают культуру в течение 14-16 ч до достижения максимально количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры.

Полученную культуральную жидкость в объеме 7000-8000 л с бактериальными клетками и спорами сливают и добавляют стабилизатор (гуми в концентрации 0,5-2,0%; или сульфит натрия в концентрации 2-6%) и используют в качестве препарата Фитоспорин (жидкий).

Предлагаемый способ продленного периодического культивирования позволяет получить за 24-29 ч культивирования 7000-8000 л жидкого препарата Фитоспорин с содержанием бактериальных клеток 24-26 млрд. кл/мл.

Пример 2
Подращивание начинают как в примере 1, в ферментере на 10 л, но осуществляют его в течение 8-11 ч, до появления спор и накопления биомассы (24±2)•10⁹ кл/мл.

Затем культуру переносят в реактор на 100 л, разбавляя ее свежей питательной средой в 10 раз, чтобы посевная доза составляла 2,2-2,6 млрд. кл/мл и выращивают в течение 4-6 ч до концентрации клеток (24±2)•10⁹ кл/мл и далее переносят в реактор на 1000 л и вновь производят разбавление свежей питательной средой до концентрации 2,2-2,6 млрд. кл/мл и выращивают в течение 4-6 ч до концентрации клеток (24±2)•10⁹ кл/мл и переносят в реактор на 10 000 л, разбавляют свежей питательной средой до начальной концентрации клеток 2,2-2,6 млрд. кл/мл и выращивают культуру в течение 16-18 ч до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры.

Полученную культуральную жидкость в объеме 7000-8000 л с бактериальными клетками и спорами сливают и добавляют стабилизатор (гуми в концентрации 0,5-2,0%; или сульфат натрия в концентрации 2-6%) и используют в качестве препарата Фитоспорин (жидкий).

Предлагаемый способ продленного периодического культивирования позволяет получить за 30-35 ч культивирования 7000-8000 л жидкого препарата Фитоспорин с содержанием бактериальных клеток 24-26 млрд. кл./мл.

Т.о. в этом примере удлиняется процесс культивирования в среднем на 6 ч.

Пример 3
Подращивание начинают как в примере 1, в ферментере на 10 л, но осуществляют его в течение 16-18 ч, до максимальных значений биомассы (24-26)•10⁹ кл/мл и перехода в споры 70-100% популяции.

Затем культуру переносят в реактор на 100 л, разбавляя ее свежей питательной средой в 10 раз, чтобы посевная доза составляла 2,2-2,6 млрд. кл/мл. и выращивают в течение 8-10 ч до концентрации клеток (24±2)•10⁹ кл/мл и далее переносят в реактор на 1000 л и вновь производят разбавление свежей питательной средой до концентрации 2,2-2,6 млрд. кл/мл и выращивают в течение 8-10 ч до концентрации клеток (24±2)•10⁹ кл/мл и переносят в реактор на 10000 л, разбавляют свежей питательной средой до начальной концентрации клеток 2,2-2,6 млрд. кл/мл и выращивают культуру в течение 20-22 ч до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры.

Полученную культуральную жидкость в объеме 7000-8000 л с бактериальными клетками и спорами сливают и добавляют стабилизатор (гуми в концентрации 0,5-2,0%; или сульфит натрия в концентрации 2-6%) и используют в качестве препарата Фитоспорин (жидкий).

Предлагаемый способ продленного периодического культивирования позволяет получить за 40-47 ч культивирования 7000-8000 л жидкого препарата Фитоспорин с содержанием бактериальных клеток 24-26 млрд. кл/мл.

Т. о. , в этом примере удлиняется процесс культивирования по сравнению с примером 1 на 16-18 ч.

Сводные данные по производительности оптимального способа культивирования (пример 1) в сравнении с прототипом представлены в таблице.

Использованные источники информации
1. Менликеев М.Я., Смирнов В.В., Байгузина Ф.А. и др. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней / Патент N 2099947, RU, C 12 N /20, опубл. 25.12.97, бюл. N 12.

2. Мишульский А.М. Способ получения бактериального препарата из бактерий рода Bacillus /Патент RU N 2076902 C 12 N /20, A 61 K 35/74, C 12 R 1: 07, опубл. 10.04.97, бюл. N 10.

3. Масько А. А. , Лоучи М.Ф., Патоцкая Л.А. О стабильности иммобилизованных почвой ферментов и их роли в деградации гербецидов Весцi АН БССР, Сер. Бiял. н. - 1991. - N 5. - С. 47-51.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству средств защиты растений. Бактерии Bacillus subtitus культивируют при непрерывной аэрации в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли и пептон. Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве (1-2)•10⁹ кл/мл. Маточную культуру готовят путем подращивания бактерий посевного материала последовательно в реакторах возрастающих объемов. Объем каждого последующего реактора больше предыдущего в 10 раз. Культуру пересевают в экспоненциальной фазе, разбавляя ее в каждом последующем реакторе в 10 раз, так чтобы посевная доза составляла (1-2)•10⁹ кл/мл. В последнем производственном реакторе выращивают культуру в течение 14-16 ч и до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры, после чего отделяют целевой продукт в виде культуральной жидкости. Полученная культуральная жидкость содержит 22-24 млрд. кл/мл (70-100% спор). В нее добавляют стабилизатор биомассы гуми 0,5-2% или сульфит натрия 2-6%, что обеспечивает сохранение количества живых колонеобразующих клеток в препарате в течение 6-8 месяцев. 1 табл.

Способ получения препарата Фитоспорин, включающий засев питательной среды маточной культурой, глубинное культивирование в среде, содержащей минеральные соли и пептон, при постоянной аэрации, отделение целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споровой биомассой, отличающийся тем, что маточную культуру готовят путем подращивания бактерий до экспоненциальной фазы роста последовательно в реакторах возрастающих объемов, объем каждого последующего реактора больше предыдущего в 10 раз, разбавляют ее в каждом последующем реакторе в 10 раз до получения концентрации бактериальных клеток (1 - 2)•10⁹ кл/мл, глубинное культивирование осуществляют в течение 14-16 ч до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры, а целевой продукт смешивают со стабилизатором биомассы - гуми или сульфитом натрия в количествах, соответственно равных 0,5 - 2 и 2 - 6%.