СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФИТОСПОРИН Российский патент 1999 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству бактериальных препаратов на основе бактерий рода Bacillus, применяющихся в сельском хозяйстве, ветеринарии и медицине, а также для иных целей, везде, где используются бактерии рода Bacillus.

В настоящее время создан биопрепарат Фитоспорин на основе живых клеток на спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26 ВНИИСХМ 128 для защиты растений от комплекса болезней (патент N 2099947).

Препарат содержит живые клетки и споры B. subtilis и наполнитель. Препарат разлит в стерильные ампулы, лиофильно высушен и запаян. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат, сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при лиофильном высушивании препарата.

Однако недостатком предложенного способа получения биопрепарата Фитоспорина является необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для лиофильной сушки, а сам период сушки довольно длителен (50 - 80 ч).

Известен способ получения препарата из бактерий рода Bacillus (RU N 2076902, C 12 N 1/20) методом жидкостного глубинного культивирования, включающий засев питательной среды маточной культурой одной из предыдущих генераций (т. е. споровой культурой) в количестве 1 - 2% от объема засеваемой среды (т.е. (1,6 - 3)•10⁷ кл/мл), культивирование проводят 14 суток при температуре 35 - 37^oC и отделяют целевой продукт в виде спор. Наполнитель или стабилизатор не используется, а используется естественное свойство бактерий переходить в споры, которые хорошо сохраняются, для непосредственного использования получающейся взвеси спор в отработанной среде в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки, что позволяет снизить производственные затраты за счет экономии на лиофильной сушке.

Однако недостатками способа, принятого за прототип, являются следующие.

1. Длительность процесса культивирования: культивирование проводят 14 суток.

2. Низкий выход биомассы: в 1 мл получают 1,6 - 3 млрд. живых клеток в форме спор.

3. Недостаточно длительный срок хранения: в течение 4 месяцев хранения при температурах +6^oC и при комнатной температуре 18 - 25^oC не снижается количество живых спор.

4. Недостаточный объем получаемого препарата: получают за 1 цикл культивирования 100 л.

Задача изобретения - разработать способ получения бактерийного препарата из бактерий рода Bacillus более производительный в реакторах обычных объемов (на 100 л), менее длительный и с большим сроком хранения качественной биомассы в жидком виде, без использования лиофильной сушки.

Поставленная задача решается получением биомассы штамма Bacillus subtilis 26 путем многоциклического гомогенного глубинного культивирования в жидкой питательной среде следующего состава, %: пептон ферментативный 0,2 - 1,0, магний сернокислый 0,01 - 0,05, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,01 - 0,05; натрия цитрат 0,1 - 0,5; медь сернокислая 0,0001 - 0,001; цинк сернокислый 0,0001 - 0,001; железо сернокислое 0,00001 - 0,0001; кальций хлористый 0,01 - 0,05; марганец сернокислый 0,001 - 0,01; глюкоза 0,2 - 1,0; вода остальное.

Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве (1-3)•10⁹ кл/мл, культивирование проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 250 - 300 об/мин в течение 8 - 11 часов, до появления первых спор, половину объема ректора культуральной жидкости сливают и добавляют в том же объеме свежую питательную среду; культивирование продолжают до восстановления концентрации клеток и затем вновь сливают половину объема реактора культуральной жидкости, добавляя в том же объеме свежую питательную среду и далее смешивают целевой продукт со стабилизатором биомассы: гуми 0,5 - 2% или сульфит натрия 2 - 6%.

За 10 отъемно-доливных циклов, в течение 40 - 50 часов можно получить 350 - 400 л культуральной жидкости.

Полученная культуральная жидкость содержит 22 - 24 млрд. кл/мл (70 - 100% спор). К полученной биомассе добавляется стабилизатор (гуми 0,5 - 2% или сульфит натрия 2 - 6%), что обеспечивает сохранение количества живых колониеобразующих клеток в препарате в течение 6 - 8 месяцев. Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу штамма B. subtilis 26 и стабилизатор биомассы, используется в качестве бактерийного препарата Фитоспорин в жидкой форме.

Использование гуми, как стабилизатора биомассы препарата Фитоспорин, улучшает его свойства в качестве сельскохозяйственного препарата за счет обогащения гуминовыми кислотами, полезными для почвообразования.

Если биомасса бактерий рода Bacillus используется для получения биопрепаратов, применяемых в ветеринарии или медицине, в качестве стабилизатора биомассы используют сульфит натрия в дозе 2 - 6%.

Пример 1.

Подращивание проводят в реакторе на 10 л или 100 л. Культивирование проводят в реакторе на 100 л.

Посевным материалом для подращивания служила культура штамма Bacillus subtilis 26 Д, выращенная на агаризованной полусинтетической питательной среде того же состава, что и среда для культивирования, в течение 18 - 24 часов.

В качестве посевного материала для основного процесса культивирования использовали популяцию штамма в экспоненциальной фазе роста, выращенную в жидкой полусинтетической питательной среде в течение 4 часов. Посевной материал вносили однократно в количестве 20% от объема используемой для культивирования питательной среды. Посевная доза составляла (1-3)•10⁹ кл/мл.

Подращивание и последующее культивирование штамма Bacillus subtilis 26Д вели на полусинтетической питательной среде, содержащей минеральные соли и пептон, в реакторе Биор-100 при 37^oC, при насыщении среды кислородом в предалах 60 - 70% и перемешивании со скоростью вращения мешалки 250 - 300 об/мин.

Контроль за ростом культуры проводили путем отбора проб через каждые 2 часа и определении концентрации микробных клеток по оптическому стандарту мутности и на ФЕК 56М, количество живых колониеобразующих клеток (КОЕ) определяли высевом на плотные питательные среды, наличие спор определяли в мазках культуры, окрашенных по Грамму.

Первый слив культуральной жидкости в количестве 0,5 объема питательной среды осуществили через 3 часа от начала культивирования, т.е. в конце экспоненциальной фазы, когда наблюдается максимальная скорость роста микроорганизмов, и долили свежей питательной средой до первоначального объема. В последующих циклах сливы и доливы производили в таком же объеме, при этом наблюдалось восстановление численности микробных клеток за 1,5 - 2 часа. Концентрация микроорганизмов колебалась около одной и той же постоянной величины (18±2)•10⁹ кл/мл.

После каждого слива культуральной жидкости в нее добавляется стабилизатор. За 10 отъемно-доливных циклов, в течение 20 - 25 часов можно получить 350 - 400 л культуральной жидкости с концентрацией клеток (18±2)•10⁹ кл/мл.

Однако было установлено, что слив экспоненциальной культуры Bacillus subtilis ведет к значительному лизису клеточной популяции в течение времени, несмотря на присутствие стабилизатора, поэтому получение такой биомассы нецелесообразно.

Пример 2 (оптимальный).

Подращивание и культивирование осуществляют как в примере 1.

Первый отъем-долив произвели через 8 - 11 часов от начала процесса, когда было отмечено появление спор и количество биомассы составляло (24±2)•10⁹ кл/мл. Половину объема реактора культуральной жидкости, в количестве 30 - 35 л сливают и добавляют в том же объеме свежую питательную среду. Культивирование продолжают до восстановления концентрации клеток до (24±2)•10⁹ кл/мл и затем вновь сливают половину объема реактора культуральной жидкости, добавляя в том же объеме свежую питательную среду.

В качестве посевного материала в каждом последующем цикле, начиная со второго, служила культуральная жидкость стационарной фазы, содержащая споры. Поэтому в начале каждого цикла, начиная со второго, отмечалась лаг-фаза продолжительностью 0,5 - 1,0 часа. Численность микробных клеток после отъема-долива восстанавливалась за 4 - 6 часов. Количество спор возрастало от цикла к циклу и в 10 цикле была получена культуральная жидкость, содержащая 80% спор.

После каждого слива культуральной жидкости в нее добавляется стабилизатор. За 10 отъемно-доливных циклов, в течение 40 - 50 часов можно получить 350 - 400 л культуральной жидкости с концентрацией клеток 22 - 24 млрд. кл/мл.

Пример 3.

Подращивание и культивирование осуществляют, как в примере 1.

Через 16 - 18 часов культивирования, когда биомасса достигает максимальных значений (24-26)•10⁹ кл/мл и наблюдается переход в споры 80 - 100% популяции, половину объема реактора культуральной жидкости, в количестве 30 - 35 л сливают и добавляют в том же объеме свежую питательную среду. Культивирование продолжают до восстановления концентрации клеток до (20±5)•10⁹ кг/мл и затем вновь сливают половину объема реактора культуральной жидкости, добавляя в том же объеме свежую питательную среду. Численность микробных клеток после отъема-долива восстанавливалась лишь частично, за 8 - 10 часов.

После каждого слива культуральной жидкости в нее добавляется стабилизатор. За 10 отъемно-доливных циклов, в течение 96 - 120 часов можно получить 350 - 400 л культуральной жидкости с концентрацией клеток 15 - 17 млрд. кл/мл.

Сводные данные по производительности оптимального способа культивирования (пример 2) в сравнении с прототипом представлены в таблице.

Использованные источники информации
1. Менликеев М.Я., Смирнов В.В., Байгузина Ф.А. и др. Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней /Патент N 2099947, RU, C 12 N 1/20, опубл. 25.12.97, бюл. N 12.

2. Мишульский А.М. Способ получения бактеририального препарата из бактерий рода Bacillus /Патент RU N 2076902, C 12 N 1/20, A 61 K 35/74, C 12 R 1:07, опубл. 10.04.97, бюл. N 10.

Бактерии культивируют при 35 - 37^oC в течение 40-50 ч с непрерывной аэрацией при насыщении среды кислородом 60 - 70% и перемешивании со скоростью вращения мешалки 250 - 300 об/мин. Используют при этом жидкую питательную среду, содержащую пептон ферментативный, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрия цитрат, медь сернокислую, цинк сернокислый, железо сернокислое, кальций хлористый, марганец сернокислый, глюкозу и воду. Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве (1-3)х10⁹кл/мл. Культивирование проводят в течение 8-11 ч, до появления первых спор. Половину объема реактора культуральной жидкости сливают и добавляют в том же объеме свежую питательную среду. Культивирование продолжают до восстановления концентрации клеток. Затем вновь сливают половину объема реактора культуральной жидкости, добавляя в том же объеме свежую питательную среду. Далее смешивают целевой продукт со стабилизатором биомассы: гуми 0,5-2% или сульфит натрия 2-6%. За 10 отъемно-доливных циклов, в течение 40-50 ч можно получить 350-400 л культуральной жидкости с концентрацией клеток 22-24 млрд.кл/мл. Культуральная жидкость, содержащая споровую биомассу, например, штамма B.subtilis 26 и стабилизатор биомассы используют в качестве бактерийного препарата Фитоспорин в жидкой форме. Изобретение позволяет повысить срок хранения препарата без лиофилизации, а также повысить производительность способа его получения. 1 табл.

Способ получения бактериального препарата из бактерий рода Bacillus, включающий засев питательной среды маточной культурой, жидкостное культивирование в среде, содержащей минеральные соли и пептон при постоянной аэрации, и отделение целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споровой биомассой, отличающийся тем, что маточную культуру засевают в количестве (1 - 3) х 10⁹ кл/мл в экспоненциальной фазе роста, культивирование проводят при постоянном перемешивании до появления спор, далее сливают половину объема культуральной жидкости и добавляют в том же объеме свежую питательную среду и вновь культивируют до восстановления концентрации спор, повторно сливают половину объема культуральной жидкости и добавляют в том же объеме свежую питательную среду и после отделения целевого продукта его смешивают со стабилизатором: гуми или сульфит натрия в количествах, соответственно равных 0,5 - 2 и 2 - 6 об.%.