Способ определения миграционной способности лейкоцитов периферической крови Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

vj

о:) Изобретение относится к медицине точнее к клинической иммунологии, касается оценки состояния клеточноопосредованного иммунитета у челове ка и может найти применение fe изучении иммунопатологии человека, например, при инфекционных.заболевани ях, при аутоиммунныхРасстройствах, после транспланции органов,при опух левых заболеваниях, при контактной гиперчувствительности и при иммунодефицитах, а также в исследовании иммунобиологии лимфоцитов и клеточных взаимодействий, связанных с иммунным ответом. Известен Ьпособ определения миграционной способности лейкоцитов в капилляре 1. Однако данный способ трудоемок в исполнении, а кроме того, нестандартность капилляров, адсорбция кле ток на стекле приводит к снижению чувствительности способа. Известен также способ определени миграционной способности лейкоцитов в агаре 2. Однако известный способ недостаточно точен, так как зоны миграции имеют рыхлые, трудно определяемые границы. Цель изобретения - повышение точ ности способа. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения миграционной способности лейкоцитов путем инкубации их в агаре, содержащем сыворотку человека G последующей окраской зон миграции и определением их площади, инкубацию лейкоцитов осуществляют в агаре, содержащем 0,8-1,2% сыворотки . Способ осуществляют следующим об разом. - 1..Приготовление агара. Павеску 3,0 г агара Дифко см шивают; с 97 мл 0,05 Мтрис -НС1 буфе ра рН 7,3, содержащего 0,9% NaCl. Смесь выдерживают 15 мин при комнат ной температуре, а затем нагревают на водяной бане до образования свет лого гомогенного раствора. Готовый 3%-ный агар разливают в стерильные пробирки -по 5 мл и помещеиот в холодильник (14°С) , где он Х1 анится до момента использования. 2. Приготовление агаровых блоко с содержанием сыворотки 1,5%. 4,85 мл среды 199 смешивают с 0,15 мл телячьей сыворотки и с 15 мкл раствора мономицина с исходной концентрацией 1,1 г/мл. Получен ную смесь объемом 5,015 мл нагревают до 52°С и смешивают с 5 мл расплавленного на водяной бане и охлаж лажденного до 51°С раствора 3%-ного агара, быстро перемешивают и сразу же разливают по 1 мл в платиковые кЗГмеры диаметром 2 см. После застывания агара камеры перевертывают гелем вверх и ставят в эксикатор, где создают влажную атмосферу с 5%-ным содержанием CQ2, Эксикатор помещают в холодильник (+4°С). 3.Приготовление агаровых блоков с содержанием сыворотки 1%. 9,85 мл среды 199 смещивают с 0,15 мл телячьей сыворотки и с 20 мкл раствора мономицина с исходной концентрацией 0,1 г/мл. Полученную смесь объемом 10,02 мл нагревают до 52°С и смешивают с 5 мл расплавленного на водяной бане и охлажденного до раствора 3%-ного агара,быстро перемешивают и сразу же разливают по 1 мл в пластиковые камеры диаметром 2 см. После застывания агара камеры перевертывают гелем вверх и ставят в эксикатор, где создают влажную атмосферу с 5%-ным содержанием СОз. Эксикатор помещают в холодильник (+4°С). 4.Приготовление суспензии лейкоцитов. Испытание проводят на свежей крови одного донора, собранной в объеме 10 мл в пробирку с консервантом гепаринов. Пока готовят агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,5 и 1,0%,пробирка с кровью стоит при комнатной температуре 45 мин. За это время эритроциты оседают, плазму, обогащенную лейкоцитами, отбирают и отцентриФугируют при 1000 об/мин 5 мин. Осадок, содержащий лейкоциты, трижды отмывают средой 199 при тех же условиях. Осадок лейкоцитов после заключительного отмывания ресуспендируют в среде 199, подсчитывают концентрацию клеток и доводят ее до концентрации 3,510 /мл. Получают суспензию лейкоцитов объемом 80 мкл с концентрацией 3, 1 мл. 5.Постановка реакции миграции лейкоцитов. В охлажденных агаровых блоках с концентрацией сыворотки 1,5 и 1,0% пробойником диаметром 2,5 мм делают лунки. Смешивают 30 мкл рабочей суспензии клеток с 30 мкл среды 199 и из этой смеси вносят в 3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,0% и в 3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,5% по 10 мкл смеси в каждую лунку. Эти лунки контрольные, в них оценивают миграцию лейкоцитов без антигена. В другой пробирке смешивают 30 мкл рабочей суспензии клеток и 30 мкл раствора препарата антигена, полученного из удаленных при тонзилэктомии миндалин. Из этой смеси вносят в 3 лунки агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,5% и в 3 лунки агаровых блоков с концентра цией сыворотки 1,0% по 10 мкл смеси в каждую лун-ку. Все агаровые блоки ,помещают в эксикатор с влажной атмо ферой, содержащей 5% 002- Эксикатор с агаровыми блоками помещают в термостат при 37°С. б. Оценка результатов миграции. На следующий день после 17 ч инкубации при 37°С агаровые блоки вынимают из эксикатора, заливают 10%-ным раствором формалина на 1ч для фиксирования клеток. Затем формалин сливают, гели подсушивают в п токе воздуха до исчезновения следов влаги в лунках и удаляют гель из камер при помсади скальпеля. Размеры зон миграции оценивают планиметриче ки с помощью аппарата Микрофот ти 5па-1. Каждую зону миграции независимо снимают 4 человека одинаково квалификации. После этого з.оны мигр ции окрашивают 0,2%-ным водным раст вором красителя трипановый синий и те же 4 человека определяют размеры тех же зон миграции, но уже после окрашивания. Для расчета индекса миграции (ИМ) используют формулу .sв E§- ssI5,00% Пло1.адь круга контроля или (Радиус зоны в контроле) Пример. 5мл 3%-ного агар Дифко-, приготовленного по прототипу на 0,05 М трис -НС1 буфере рН 7,3, содержащем 0,94 NaCl, в день опыта расплавляют, остужают до 50-54°С исмешивают с нагретыми до той же температуры 8,5 мл среды 199, содержащей 30000 ед мономицина, и с 1,5 мл сыворотки человека 1 группы4 Смесь быстро перемешивают и сразу же разливают в аяатиковые камер ы диаметром 2 см по 1 мл полученного 1% агара концентрацией сыво ротки 10%. Высота агара в камерах 3 мм. После застывания агара камеры переворачивают вверх дном и ставят в эксикатор с 5%-ным содержанием COjo Эксикатор помещают в холодную камеру (). I Эксперимент проводят на свежей крови одного донора, собранной в пр бирку с консервантом гепаринов. Кровь выдерживают при комнатной тем пературе 30-40 мин, чтобы осели эри троциты. Плазму, содержащую лейкоци ты, отбирают и центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин при .Осадок, содержащий лейкоциты, трижды отмыва ют средой 199. осадок лейкоцитов после заключительной от1лывки ресуспендируют в среде 199, подсчитывают концентрацию клеток и доводят ее до 3-10°клеток/мл. В охлс1жденных агаровых блоках про бойником диаметром 2,5 мм делают лунки. В каждую лунку вносят по 10 мкл рабочей суспензии клеток, полученной путем предварительного смешивания равных объемов исходной клеточной суспензии со средой 199 (контроль) или с раствором антигена (опыт). После этого агаровые блоки помещают в эксикатор с влажной атмосферой, содержащей 5% СО. Инкубацию проводят при 37°С 18-20 ч. На следующий день агаровые блоки заливают 10%-ным раствором фррм.алина, выдерживают 1 ч и после удашения слоя геля оценивают величину зоны миграции планиметрически при помощи аппарата Микрофот тип 5ПО-1о Каждую зону миграции независимо снимают 4 человека одинаковой квалификации. Полученные результаты представлены в табл. 1 (в табл. 1-8 R, - радиус зоны миграции в контроле; R радиус зоны миграции в опыте (с антигеном) ; ИМ - индекс миграции, опре(R-l дедяемый по формуле ИМ - ЧОО%;; ) 1, 2, 3, 4 - номера экспериментато.ров, снимавших зоны, миграции) . П р и м е р 2. Все процедуры выполняют, как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,5%, Полученные результаты приведены в табл. 2. Примерз. Все процедуры выполняют,как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,29%. Полученные результаты приведены в табл. 3. Пример4. Все процедуры выполняют,, как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0% Полученные результаты приведены в табл. 4. П р и м е р 5. Все процедуры выполняют , как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией сыворотки 0,8% Полученные результаты приведены, в табд... 5. Примере. Все процедуры выполняют, как в примере 1, за исключением того, что используют агаровые блоки с концентрацией дыворотки 0,5% Полученные результаты приведены в табл. б. П р и м е р 7. Все процедуры выполняют, как в примере 2, за исключением того, что после снятия размеров зон миграции последние окрашивают 0,2%-ным водным раствором трипановой сини и те же 4 человека определяют размеры тех же зон миграции, но уже после окрашивания.

Результаты приведены в табл. 7..

Примере. Все процедуры выполняют, как в примере 4, за исключением того, что посл.е снятия размеров зон миграции последние окрашивают 0,2%-ным водным раствором трипановой сини и те же 4 человека определяют размеры тех же зон миграции но уже после окрашивания.

Результаты приведены в табл. 8.. V,

При сравнении данных, приведенных в табл. 1-6, видно, что при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки более 1,5% разброс в значениях индексов миграции , полученных 4 различными людьми одинаковой квалификации при снятии одной и той же зоны миграции, очень велик и составляет 44,3%. Если максимально допустимый разброс в значении ИМ составляет 10%, то такие большие отклонения, как 44%. (при концентрации сыворотки в агаровых блоках 10%) могут приводить к неправильной оценке иммунореактив1R.3,9 RO. 4,6 ИМ % 139,5 .« I |1 R 3,85 RQ 3,9

ноСти обследуемого пациента. Действительно, при истинном значении ИМ, близком к норме, т.е. к 100%, экспериментатор с равной вероятностью может получить значение ИМ как меньше 100%, т.е. ингибирование, так и больше 100%, т.е. отсутствие ингибирования. В первом случае это .будет указывать на плохое состояние пациента и на необходимость проведения специфической терапии, а во втором - на удовлетворительное состояние пациента, когда специфическое .лечение может быть и не показано.

Как видно из данных, представленных в табл. 7 и 8, предлагаемая окраска зон миграции 0,2%-ным водным раствором красителя трипановая синь снижает ошибку в определении размеров зон. миграции с 8% (табл. 4, агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0% без окраски) до 2,5% (табл. 8, агаровые блоки с концентрацией сыворотки 1,0%, с окраской).

Таким образом, использование предлагаемого способа определения миграционной способности лейкоцитов периферической крови обеспечивает по сравнению с известными повышение точности с 44,3 до 2,5% и экономию средств за счет уменьшения концентрации сыворотки в агаровых блоках в 10 раз (с 10 до 1,2-0,8%). Значение индекса миграции tИM )лейкоцитов периферической крови при использовании ага ровых блоков концентрацией сыворотки 10% 234 Интервал Разброс Среднее 3,68 3,42 3,59 3,42-3,9 0,48 3,647±Р,24 3,40 3,58 4,00 3,40-4,6 1,23,895+0,6 95,2 110 12 95,2-139,5 /44,3 117,2±22,15 --.-.,----- - ---- Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,5% I 2 3 14 Интервал Ра.зброс Среднее Iзначение 3,80 3,73 3,38 3,38-3,85 0,47 3,69tO,235 4,18 3,28 3,72 3,28-4,18 0,9 3,77+0,45 Таблица 1 значение Таблица 2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИГРАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ путем инкубации их в агаре, содержащем сыворотку человека с последующей окраской зон миграции и опр|вделением их площади, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, инкубацию лейкоцитов осуществляют в агаре, содержащем 0,8-1,2% сыворотки.

ИМ,% 102,5 121 87,5 121 87,5-121

108tl6,75

33,5

Значение ИМ лейксщитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,2% R 3,37 3,3 3,42 3,4 3/3-3,42 R 3,7 3,38 3,58 3,6 3,38-3,7 ИМ,% 120 . 105 109,5 112 105-120

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агарйых блоков с концентрацией сыворотки 1,6% R., 3:33,32 3,25 3,32 3,25-3,32 R 3,55 3,55 3,5 3,45 3,45-3,55 ИМ,% 116114108 .108 108-116

Значение ИМ лейкоцитов периферической кро- . ви при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 0,8% Н 3,24 3,26 3,24 3,32 3,24-3,32 RP 3,43,463,55 5,42 3,3-3,55 ИУ1,% 111,65 112120 106106-120

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5 0,12 3,37+0,06 0,32 3,,16 15 Hi,6t7,5 0,07 3,,035 0,10 3,54tO,05 8111,5+4,0 0,08 3,,04 0,15 3,46tO,075 14112,37+7

Значение ИМ лейкоцитов периферической крови при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 0,5% R,. 3,03,15 3,08 3,12 3,0-3,15 Rj 3,25 3,45 3,1 3,3 3,1-3,45 ИМ,% 118 120 101,5 112 101,5-Г20

ИМ лейкоцитов периферической кроокрашивания при использовании

блоков с концентрацией сыворотки 1,5%

RK 3,65 3,88 3,6 3,623,6-3,880,22 3,,11

. - - «...-.«,- - .- ...-.

RO 3,75 3,95 3,82 3,83,75-3,950,23,83iO;i

ИМ,% 106 ИЗ112 110

Значения ИМ лейкоцитов периферической крови после окрашивания зон миграции, и при использовании агаровых блоков с концентрацией сыворотки 1,0%

Таблица 6

Таблица7

- %

103-112

107,75±4,5

Т а б л и ц а

. 0,15 3,087+0,075 0,35 3,275+0,175 18,5 112,6+9,25