СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТКАНЕВОГО ХОЛЕСТЕРИНА КОЖИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к области медицины, точнее к способу исследования кожи биохимическими методами. Изобретение может быть использовано также в косметологии, фармакологии, криминалистике и т.п. для определения содержания холестерина в коже, как свободного, так и общего.

В условиях клиники определение холестерина кожи позволяет неинвазивно, т. е. без взятия образца крови или биопсийного материала оценивать уровень тканевого холестерина.

Известен способ определения на поверхности кожи различных химических веществ, находящихся в кровеносном русле человека или животного (глюкоза, алкоголь, лактат, гипоксантин). Способ включает введение под кожу фермента, иммобилизованного на поверхности силикона, прогрев до 38 - 44^oC участка кожи и регистрацию локального изменения концентрации кислорода или перекиси водорода на коже с помощью электрохимического датчика (1).

Недостаток известного способа - сложность введения под кожу иммобилизованного фермента, образование перекиси водорода непосредственно в тканях, что может привести к нежелательным последствиям (переход гемоглобина в метгемоглобин) - развитие гипоксии.

Известен способ определения холестерина кожи путем взятия образца ткани с последующей экстракцией холестерина. Метод позволяет определить не только количество общего холестерина, но и раздельно свободного и этерифицированного (2).

Развитием этого метода является экстракционный метод, согласно которому экстракцию холестерина производят без забора образца ткани непосредственно на участке живой кожи. В качестве экстрагента используют смесь этилового спирта с эфиром. Пробирку с экстрагентом прикладывают к поверхности кожи на несколько минут, липиды, находящиеся в поверхностных слоях кожи, растворяются и переходят в раствор экстрагента, после чего проводится выпаривание растворителя и определение веществ, перешедших в жидкую фазу (3).

Содержание холестерина в эпидермисе отражает накопление холестерина в коже и коррелирует с содержанием последнего в аорте, а также с площадью поражения аорты при атеросклерозе (3). Таким образом, определение содержания холестерина в кожи позволяет получить уникальную информацию о состоянии тканевого пула холестерина, а это чрезвычайно важно как с позиций ранней диагностики атеросклероза (доклинической стадии), так и для целей контроля за лечением больных атеросклерозом.

В фармакологии способ определения холестерина в коже позволяет проводить оценку эффективности лекарственных средств, влияющих как на синтез холестерина в тканях (группа статинов), так и на его выведение из организма с помощью различных сорбентов.

Недостаток известного способа - необходимость проведения биопсии, контакт кожи с раствором экстрагентов, а также длительность проведения анализа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения холестерина кожи, включающий подготовку участка поверхности кожи, нанесение на кожу (или другую холестеринсодержащую поверхность) дозированного количества раствора - аффинно - ферментативного конъюгата общей структуры А - С - В, где А - соединение, способное связываться с холестерином (аффинат), С - связующий мостик или полимер, B-фермент, дающий в результате превращения соответствующего субстрата цветной продукт. Количество холестерина определяют по интенсивности перехода красителя в окрашенную форму (4).

Недостатки этого способа - ограниченная область применения, т.е. невозможность определения этерифицированного холестерина, низкая специфичность анализа, а именно взаимодействие конъюгата не только с холестерином, но и с другими липидами.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение - повышение специфичности, упрощение и расширение области применения способа, увеличение точности определения холестерина в коже человека и других конденсированных средах.

Поставленная задача решена тем, что в способе определения холестерина кожи, включающем подготовку участка поверхности, нанесение на поверхность кожи дозированного количества водного раствора фермента с добавкой поверхностно-активных веществ, экспозицию, оценку концентрации холестерина в реакционном растворе и расчет концентрации холестерина кожи, согласно предложению после подготовки участка поверхности ограничивают с помощью приспособления площадь контакта кожи с раствором фермента и поверхностно-активного вещества, в качестве раствора фермента с поверхностно-активным веществом используют для определения свободного тканевого холестерина композицию состава, мас.%:
Холестериноксидаза - 2,0 - 2,5 ед
Дезоксихолевокислый натрий - 0,04 - 0,06
3-(Додецилдиметиламмоний)-пропансульфонат - 0,1 - 0,2
Фосфатный буфер pH 6,8 - Остальное до 100%,
а для определения общего холестерина композицию состава, мас.%:
Холестериноксидаза - 2,0 - 2,5 ед
Холестеринэстераза - 3 - 5 ед
Дезоксихолевокислый натрий - 0,04 - 0,06
3-(Додецилдиметиламмоний)-пропансульфонат - 0,1 - 0,2
Фосфатный буфер pH 6,8 - Остальное до 100%,
экспозицию раствора на коже для определения свободного холестерина проводят в течение 2 минут и 10 минут для определения общего холестерина, а оценку концентрации холестерина осуществляют путем прямого измерения концентрации перекиси водорода в реакционном растворе. Ограничение площади контакта кожи с раствором поверхностно-активного вещества осуществляют с помощью герметизируемой кюветы без дна с основанием, фиксируемым на коже.

Используют холестериноксидазу, полученную из различных источников (Brevibacterium sp. , Nocardia erythropolis). Образующуюся в ходе взаимодействия холестерина с холестериноксидазой перекись водорода определяют с помощью электрохимического датчика или путем использования спектрофотометрической техники.

Холестериноксидаза катализирует окисление холестерина с участием молекулярного кислорода и образованием перекиси водорода:
холестерин + O₂ = 4-холестен-3-он + H₂O₂
При использовании смеси ПАВ - ионного детергента (дезоксихолевокислого натрия (ДОХ) в концентрации 0,04-0,06% и цвиттерионного детергента - 3-(додецил-диметиламмоний)-пропансульфоната (ДАПС) в концентрации 0,1-0,2% выявлена оптимальная скорость и полнота окисления холестерина. Эта реакционная система позволяет повысить эффективность действия холестериноксидазы в результате снижения ингибирующего действия поверхностно - активных веществ и снизить расход дорогостоящих детергентов. Такая композиция детергентов обеспечивает доступность свободного холестерина и высокую скорость его окисления. Это позволило использовать при определении свободного холестерина сравнительно низкие концентрации холестериноксидазы - при применении кинетического варианта измерений всего 4-8 нмоль на мл реакционной смеси, а при определении по конечной точке для проведения полного окисления холестерина за 10 мин достаточно 20 нмоль фермента на мл реакционной смеси.

Фотометрические методы позволяют достигать нижнего предела обнаружения субстратов оксидаз около 10^-6 М.

Электрохимический датчик с холестериноксидазой, иммобилизованной на коллагеновой мембране позволяет определять концентрацию холестерина от 10^-4 до 0,08 мМ (6, 7).

В таблице 1 приведены данные, полученные при окислении свободного холестерина, содержащегося в контрольном растворе холестерина при разных соотношениях двух данных детергентов. Результаты приведены в единицах оптической плотности (ОП) и скорости реакции окисления по величине угла наклона кинетической кривой (V).

Способ реализуется следующим образом. Предварительно участок кожи, на котором проводится измерение, протирается тампоном, смоченным этиловым спиртом. На подготовленном участке поверхности кожи фиксируется специальное приспособление - герметизируемая кювета без дна (Фиг. 1), где 1 - кювета с резьбой для фиксации электрохимического датчика или крышки; 2 - подложка, обеспечивающая фиксацию кюветы и ее герметичность на поверхности кожи. Кювета позволяет ограничить площадь поверхности кожи (1 см²), предназначенной для анализа, и нанести на этот участок (Фиг. 2) дозированное количество (объем около 0,1 мл) раствора смеси фермента с поверхностно-активными веществами (ПАВ).

Экспозиция раствора на коже осуществляется в течение двух минут. Во время экспозиции раствора, содержащего смесь фермента с ПАВ, происходит наработка перекиси водорода, концентрация которой прямо пропорциональна содержанию холестерина. После экспозиции раствор, содержащий перекись водорода, переносят на электрохимический электрод, где и происходит измерение концентрации образовавшейся перекиси водорода (Фиг.4).

Предложен вариант способа, в котором электрохимический электрод приводят в соприкосновение с раствором, находящимся в кювете непосредственно на поверхности кожи (Фиг.3.).

В случае использования спектрофотометрического метода измерения концентрации перекиси водорода раствор, содержащий перекись водорода, переносится в кювету фотометра, где находится проявляющая система (фермент пероксидаза и субстрат). Концентрацию перекиси определяют по величине оптической плотности раствора, прямо пропорциональной концентрации перекиси водорода. Определение концентрации перекиси водорода в жидкой фазе с использованием фотометра предпочтительно в лабораторных условиях. Вне лаборатории, например, в домашней диагностике возможно применение методов "сухой" химии. С этой целью могут быть использованы колориметрические индикаторы на бумажных полосах (стрипы), позволяющие определять концентрацию перекиси водорода в диапазоне 0,2 - 20 мг/л, что полностью перекрывает необходимый диапазон концентраций.

При работе с колориметрическим индикатором (стрипом) бумажная полоса погружается в раствор проэкспонировавшегося фермента и ПАВ, находящегося на поверхности кожи в кювете. После погружения оценивают изменение цвета полосы, также определяемое концентрацией образовавшейся перекиси водорода либо с помощью цветной шкалы, либо с помощью портативного отражательного фотометра.

Важное диагностическое значение имеет определение не только свободного, но и этерифицированного холестерина, так как при ряде заболеваний меняется их соотношение. Определение этерифицированного холестерина позволяет проводить определение общего холестерина, являющегося суммой свободного и этерифицированного холестерина. С этой целью нами проводился ферментативный гидролиз эфиров холестерина ферментом холестеринэстеразой, полученным как из тканей поджелудочной железы, так и микробного происхождения. Для определения этерифицированного холестерина на поверхность кожи наносился раствор смеси ферментов - холестеринэстеразы с холестериноксидазой, содержащий ПАВ. Раствор экспонируют 10 минут, после чего также проводят определение перекиси водорода одним из перечисленных выше методов.

Пример 1.

Определение свободного холестерина у здоровых добровольцев с помощью электрохимического датчика. На поверхность кожи ладони (область тенара) устанавливается кювета, показанная на фиг. 1. Кювета позволяет фиксировать на поверхности кожи в 1 см² объем раствора фермента и ПАВ, равный 0,1 мл. Предварительно поверхность кожи протирается раствором этилового спирта. После установки кюветы в нее заливается раствор следующего состава, мас.%:
Холестериноксидаза - 2,0 - 2,5 ед
Дезоксихолевокислый натрий - 0,06
3-(Додецилдиметиламмоний)-пропансульфонат - 0,2
Фосфатный буфер pH 6,8 - Остальное до 100%
После инкубации раствора на поверхности кожи в течение двух минут забирается 0,05 мл раствора и переносится на измерительную поверхность электрохимического датчика. Через 5 секунд считывается результат - величина тока, пропорциональная содержанию образовавшейся перекиси водорода. Пересчетное устройство позволяет выводить на жидкокристаллический экран величину содержания свободного холестерина на поверхности кожи, выраженную либо в мкмоль/л, либо в мкг/см².

Определение холестерина с использованием метода (4) позволяет выявить одно, два или три окрашенных пятна. В таблице 2 приведены результаты одновременного проведения этих двух тестов. Видно, что колебания содержания свободного холестерина к коже испытуемых при изменении почти в два раза от 10,1 до 5,5 мкмоль/л дает положительную реакцию в один крест, тогда как при концентрации холестерина 9,3 мкмоль/л у 4-го испытуемого выявлена реакция в два положительных креста (++) -
Пример 2. Определение свободного холестерина у больных стенозирующим атеросклерозом с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца (ИБС). При использовании технологии, описанной в примере 1, уровень свободного холестерина кожи у больных ИБС колебался в пределах от 18,7 до 35,8 мкмоль/л (см. таблицу 3).

Пример 3. Определение свободного холестерина с помощью специализированной бумажной полосы. На поверхность кожи ладони (область тенара) установлена кювета, позволяющая фиксировать на поверхности кожи в 1 см² объем раствора фермента и ПАВ, равный 0,1 мл. Предварительно поверхность кожи протирается раствором этилового спирта. После установки кюветы в нее заливается раствор холестериноксидазы и ПАВ, после инкубации в течение двух минут в нее обмакивается специализированная бумажная полоса. Результат определения содержания свободного холестерина кожи считывался с помощью калибровочной цветной шкалы либо по показаниям отражательного фотометра.

Пример 4. Определение общего холестерина (суммы свободного и этерифицированного) холестерина кожи. На поверхность кожи ладони установлена кювета, фиксирующая на поверхности кожи заданный объем следующего раствора:
Холестериноксидаза - 2,0-2,5 ед
Холестеринэстераза - 3-5 ед
Дезоксихолевокислый натрий - 0,04
3-(Додецилдиметиламмоний)-пропансульфонат - 0,1
Фосфатный буфер pH 6,8 - Остальное до 100%
После чего кювета закрывается специальной крышкой, так как время экспозиции в этом случае 10 минут и за это время может произойти испарение, что приведет к концентрированию растворов. В среднем в контрольной группе содержание общего холестерина превышает на 10-20% величину свободного холестерина, т. е. величина этерифицированного холестерина составляет 10 - 20% от общего холестерина кожи.

Источники информации.

1. Патент США 4458686, А 61 В 5/00, 1984.

2. Bouissou, Н. , Pieraggi, M.Th., Julian, M. Identifying arteriosclerosis and aortic ateromathosis by skin biopsy. Atherosclerosis, v.l9, pp. 449-458.

3. Lopukhin Yu. M. The skin and atherosclerosis (a three-drop test). 1992. Gordon and Breach Science Publishers S.A. UK.

4. Патент США 5,489,510, A 61 В 10/00, опублик. 1996 (прототип).

5. Авт. свид. СССР 1395677, С 12 Q 1/44, G 01 N 27/26, 1986.

6. Патент СССР 622424, G 01 N 33/16, 1976.

7. Bertrand et ai. 1981 Multipurpose electrode with different enzyme bound to collagen films. Analyt. Chim. Acta. V.126., pp. 23-34.

Изобретение позволяет определять уровень тканевого холестерина кожи в условиях клиники. Сущность изобретения состоит в том, что непосредственно на поверхность кожи наносят дозированное количество ферментсодержащей смеси, представляющей собой буферный раствор холестериноксидазы (или с добавлением холестеринэстеразы) и некоторых поверхностно-активных веществ с помощью герметизированной кюветы без дна с основанием, фиксируемым на коже. После экспозиции этой смеси на коже в реакционном растворе определяют концентрацию прореагировавшего с ферментом холестерина путем прямого определения уровня перекиси водорода. По полученным значениям перекиси водорода в реакционной смеси проводят расчет холестерина в коже. Уровень перекиси водорода определяют любыми доступными способами, например с помощью электрохимического датчика, колориметрического индикатора или спектрофотометрически при использовании пероксидазы с субстратом. 4 з.п.ф-лы, 4 ил., 3 табл.

1. Способ определения тканевого холестерина кожи, включающий подготовку участка поверхности кожи, нанесение на кожу дозированного количества ферментсодержащей смеси, экспозицию, оценку концентрации холестерина в реакционном растворе и расчет концентрации холестерина кожи, отличающийся тем, что на участке поверхности кожи ограничивают площадь контакта кожи со смесью с помощью герметизируемой емкости без дна с основанием, фиксируемым на коже, в качестве смеси используют содержащий 2,0 - 2,5 ед. холестериноксидазы, 0,04 - 0,06 мас.% дезоксихолевокислого натрия, 0,1 - 0,2 мас.% 3-(додецилдиметиламмоний)-пропансульфоната в буферном растворе при pH 6,8, а оценку концентрации холестерина в реакционном растворе осуществляют путем измерения уровня перекиси водорода. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в композицию дополнительно вносят 3 - 5 ед. холестеринэстеразы. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что измерения уровня перекиси водорода осуществляют спектрофотометрически после добавления в реакционный раствор пероксидазы с субстратом. 4. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что измерения уровня перекиси водорода осуществляют путем погружения электрохимического датчика в реакционный раствор. 5. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что измерения уровня перекиси водорода осуществляют путем погружения колориметрического индикатора в реакционный раствор.